劉 雨，李艷艷，張 偉，楊鳳梅，劉 權(quán)，李詠潔，靳瑋華，段素琴，王俊斌，陳麗雄，徐鴻界，趙 遠，和占龍

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118）

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是一種似矛頭狀的革蘭陽性雙球菌，成雙或成短鏈狀排列，為人獸共患菌。肺炎鏈球菌是一種條件致病菌，一般定植于健康人群和動物的鼻咽部，致病因子為莢膜多糖[1-2]。當(dāng)定植的環(huán)境發(fā)生變化，如宿主機體免疫力降低或有關(guān)呼吸道病原體感染宿主時，肺炎鏈球菌會突破機體的黏膜防御體系，進入下呼吸道引起肺炎，或通過咽鼓管進入中耳引發(fā)中耳炎，或穿過肺泡上皮細胞和血管引起菌血癥，或透過血腦屏障引發(fā)腦膜炎等[3-4]。上述由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病統(tǒng)稱為肺炎鏈球菌性疾?。╬neumococcal disease，PD）。據(jù)2017年WHO數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球兒童PD發(fā)病率高達0.5人次/年，全球每年大約有46萬的兒童死于肺炎鏈球菌感染[5]?？梢?，肺炎鏈球菌是引起兒童發(fā)病和死亡的主要原因之一。

肺炎是人工飼養(yǎng)實驗猴場內(nèi)常見且多發(fā)的疾病之一[6-11]。在人類和動物中，引起肺炎的病原體有細菌、支原體、病毒等，其中細菌性肺炎大多由肺炎鏈球菌引起。肺炎鏈球菌主要寄居于鼻咽部，是機體上呼吸道的一種正常定植菌，當(dāng)機體免疫功能受損時，有毒力的肺炎鏈球菌入侵人體而致病。在規(guī)模化人工繁育猴場開展早期監(jiān)測，了解和快速確定病原體攜帶狀況，針對性地制定預(yù)防措施，合理選擇抗菌藥物進行治療，是有效提高實驗猴場疾病防控能力的重要工作。然而目前實驗猴肺炎鏈球菌攜帶狀況監(jiān)測及快速檢測方法的研究報告較少，因此開展此項工作對提高實驗猴養(yǎng)殖水平，確保實驗猴質(zhì)量和減少經(jīng)濟損失具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級恒河猴（rhesus macaque，中國獼猴的一個指名亞種，學(xué)名為Macaca mulatta mulatta）80只（包括嬰猴20只，3～4月齡；成年猴30只，4～10歲；老年猴30只，11～20歲），雌雄不限，均來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長類研究中心[SCXK（滇）K2020-0005]人工繁育超20代的恒河猴種群。這些受檢猴是按照年齡組成結(jié)構(gòu)隨機抽樣選取，均飼養(yǎng)于普通環(huán)境[SYXK（滇）K2020-0008]。其中，嬰猴小籠飼養(yǎng)，每籠2只；成年猴和老年猴大籠飼養(yǎng)，每籠6～8只；均設(shè)置溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%，飼喂全價顆粒飼料[SCXK（滇）K2020-0006]，自由飲水。實驗方案經(jīng)本單位實驗動物倫理審查委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：DWSP201902034），實驗過程嚴格遵循3R原則，給予實驗動物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

實時熒光PCR法肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂、葡萄糖肉浸湯、去氧膽酸鈉和菊糖發(fā)酵管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；奧普托欣藥片購自溫州市康泰生物科技有限公司。高速冷凍離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超凈操作臺購自中國蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀器、PowerPac HC高流電泳儀和凝膠成像自動分析系統(tǒng)Image Lab購自美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品采集

用無菌棉簽將鼻、咽拭子各分成一式兩份，2～8 ℃保存，分別做培養(yǎng)鑒定和實時熒光定量PCR檢測。所有樣本須在2～3 d內(nèi)完成檢測。

1.4 肺炎鏈球菌分離培養(yǎng)及生化鑒定[12]

鼻、咽拭子樣品分別接種在哥倫比亞血培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取單個灰白色、周圍有草綠色溶血環(huán)、部分呈典型臍窩狀的可疑菌落進行革蘭染色。鏡檢顯示形態(tài)呈矛頭狀，成雙或鏈狀排列，寬端相對，尖端相背，顏色為紫色，初步確定為肺炎鏈球菌。

奧普托欣藥敏試驗：挑取革蘭染色陽性的菌落均勻密涂于哥倫比亞血培養(yǎng)基上，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將5.0 μg奧普托欣藥片緊壓到平皿中央，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，觀察并測量抑菌圈的直徑大小，抑菌圈大于14 mm時判定為藥敏陽性。

膽汁溶解試驗：挑取革蘭染色陽性的菌落，接種到含有2～3 mL葡萄糖肉浸湯的試管中培養(yǎng)24 h。然后，一支加入1～2滴10%去氧膽酸鈉，另一支加入1～2滴0.9%氯化鈉溶液（即生理鹽水）作為對照，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。觀察發(fā)現(xiàn)液體澄清透明，即確定為膽汁溶解陽性。

菊糖發(fā)酵試驗：挑取革蘭染色陽性的菌落，接種到菊糖發(fā)酵管中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察甲酚紫變?yōu)辄S色，即確定為菊糖發(fā)酵陽性。

按照國家標(biāo)準(zhǔn)的肺炎鏈球菌檢測要求，以上3個試驗均為陽性時，即可確定該樣本為肺炎鏈球菌陽性。

1.5 肺炎鏈球菌核酸檢測

肺炎鏈球菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）最低檢測限值可達到1×103拷貝/mL，與感染部位相同或感染癥狀相似且常見的其他病原體如B族鏈球菌、肺炎克雷伯菌、A組乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等細菌和人類白細胞的總核酸無交叉反應(yīng)，特異性較好，并且檢測精密度參考品的變異系數(shù)小于5%。具體檢測步驟：（1）新鮮采集的同一只恒河猴鼻、咽拭子樣本混合后經(jīng)葡萄糖肉浸湯培養(yǎng)；（2）取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心3 min后棄掉上清液，保留沉淀；（3）每管沉淀溶于50 μL DNA提取液，沉淀懸浮后100 ℃煮沸5 min；（4）1 000 r/min離心3 min，取5 μL上清液，即肺炎鏈球菌DNA，用于實時熒光定量PCR檢測。

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括PCR反應(yīng)組分5 μL、酶混合液0.2 μL、肺炎鏈球菌反應(yīng)液4 μL、無酶水10.8 μL和DNA 5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40個循環(huán)。結(jié)果判定：Ct≤35且曲線呈S型，判斷為陽性感染；Ct＞38或者未檢出，判斷為陰性感染。

1.6 PCR擴增和測序

根據(jù)GenBank肺炎鏈球菌DNA基因序列，利用Prime 5軟件設(shè)計引物，擴增目的片段長258 bp。上游引物序列為5'-GTTAAGATTGCTGATCGATTAATTGATATCC-3'，下游引物序列為5'-GTAATATGTCTTTAGGGCGTTTATGGCGATAG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用1.5節(jié)中提取的肺炎鏈球菌DNA作為模板，進行PCR擴增。擴增體系包括上下游引物各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、模板DNA 2 μL，dd H2O補至總體積25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃停止反應(yīng)。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像儀進行觀察并拍照。PCR擴增產(chǎn)物由廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用定性描述的方法，判斷肺炎鏈球菌感染情況；然后用Excel軟件錄用整理陽性數(shù)據(jù)，計算不同年齡組的帶菌率。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)特征

在哥倫比亞血瓊脂平板上接種鼻、咽拭子樣品，培養(yǎng)24 h后進行觀察，發(fā)現(xiàn)80份樣品有4份嬰猴樣品為陽性，菌落為灰白色濕潤的凸起，且周圍有草綠色溶血環(huán)，呈臍窩狀，總體表現(xiàn)為典型肺炎鏈球菌的菌落特征（圖1A）。革蘭染色后鏡檢結(jié)果顯示，該細菌為革蘭陽性鏈球菌，菌體呈成雙或短鏈狀排列（圖1B），進一步確定為肺炎鏈球菌。對結(jié)果為陽性的4只嬰猴對應(yīng)的母猴（不包括在30只成年猴中）鼻咽拭子進行細菌培養(yǎng)，均未培養(yǎng)出肺炎鏈球菌。

2.2 肺炎鏈球菌的生化特性

奧普托欣藥敏試驗測得抑菌圈直徑大小為16 mm（圖2A）。抑菌圈大于14 mm表明該菌對奧普托欣敏感，即可確定為陽性。膽汁溶解試驗中，加入10%去氧膽酸鈉溶液的試管液體澄清透明，加入生理鹽水的試管液體渾濁（圖2B），表明膽汁溶解試驗為陽性。菊糖發(fā)酵試驗中，接種菌落的菊糖發(fā)酵管中甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，加入生理鹽水的菊糖發(fā)酵管中液體顏色沒有變化，表明該菌可發(fā)酵菊糖（圖2C），即菊糖發(fā)酵試驗為陽性。通過以上試驗可確定分離獲得的菌落為肺炎鏈球菌。

圖 2 嬰猴感染肺炎鏈球菌的生化鑒定Figure 2 Biochemical identification of Streptococcus pneumoniae in infant rhesus macaques

2.3 肺炎鏈球菌實時熒光定量PCR篩查結(jié)果

鼻咽拭子樣本通過提取DNA進行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)嬰猴中4份樣本檢測結(jié)果為陽性，成年猴和老年猴檢測結(jié)果均為陰性；對結(jié)果為陽性的嬰猴的母親（不包括在30只成年猴中）進行PCR檢測，篩查結(jié)果均為陰性（圖3）。

圖 3 實時熒光定量PCR檢測不同年齡組的恒河猴肺炎鏈球菌攜帶情況Figure 3 Carriage of Streptococcus pneumoniae in rhesus macaques at different ages detected by real-time fluorescent quantitative PCR

2.4 肺炎鏈球菌PCR擴增與測序結(jié)果

用根據(jù)肺炎鏈球菌DNA序列設(shè)計的引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，目的片段長度為258 bp（圖4A）。將擴增的PCR產(chǎn)物進行測序，結(jié)果如圖4B所示。擴增的目的片段序列與GenBank中的序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)與肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA序列的同源性達97.6%以上。

圖 4 嬰猴肺炎鏈球菌感染陽性樣本的PCR擴增（A）和測序（B）結(jié)果Figure 4 PCR amplification (A) and sequencing (B) results in positive samples of Streptococcus pneumoniae infection in infant rhesus macaques

2.5 不同年齡組恒河猴的肺炎鏈球菌攜帶情況

在3～4月齡恒河猴嬰猴的鼻、咽拭子中檢測出肺炎鏈球菌，檢出率為20%（4/20）。另外對檢測結(jié)果陽性的4只嬰猴的母親進行篩查，發(fā)現(xiàn)4只母猴（30只成年猴中不包括這4只母猴）并未攜帶肺炎鏈球菌。4～20歲年齡組的恒河猴咽拭子、鼻拭子均未檢測出肺炎鏈球菌。經(jīng)過對比標(biāo)號發(fā)現(xiàn)，細菌培養(yǎng)和PCR篩查的陽性結(jié)果均一致。不同年齡組恒河猴的肺炎鏈球菌攜帶情況見表1。

表 1 不同年齡組恒河猴肺炎鏈球菌的攜帶情況Table 1 Carriage of Streptococcus pneumoniae in different age groups of rhesus macaques

3 討論

正常菌群是微生物與其宿主在共同的進化過程中形成的對人有益的微生物群，主要存在于人類體表和體腔部位，這些正常菌群大部分與細胞密切接觸并參與人體能量供給、物質(zhì)交換、遺傳信息傳遞等生命活動[13]。研究發(fā)現(xiàn)在人體鼻腔的定植微生物以葡萄球菌為最多，其次是肺炎鏈球菌、奈瑟菌、嗜血流感桿菌等。鼻咽部鏈球菌與嗜血流感桿菌的數(shù)量大，肺炎鏈球菌占比較高。多年來人們主要關(guān)注口腔鼻咽部正常菌群的致病作用，即引起內(nèi)源性感染的作用，忽視了這些菌群正常的生物拮抗、營養(yǎng)及免疫等生理作用。正常情況下，口腔鼻咽部正常菌群之間以及菌群中多種微生物之間，互相依存，互相制約，構(gòu)成一種生態(tài)平衡，發(fā)揮著重要的生理作用。基于非人靈長類動物與人的生理結(jié)構(gòu)和功能以及遺傳信息具有相似性，本研究開展了正常猴群中肺炎鏈球菌在咽鼻部定植情況的篩查，為早期該病原體的檢測提供一定的參考依據(jù)。從實驗結(jié)果可以看出，在正常猴群中肺炎鏈球菌攜帶率相對較高，如環(huán)境、個體免疫力等因素一旦發(fā)生改變將會引起肺炎的發(fā)生。因此，在實踐工作中檢測肺炎鏈球菌的同時，應(yīng)加強對動物口腔鼻咽部其他常見的正常菌群中多種微生物的監(jiān)測和研究，建立一個完善的可檢測多種微生物的技術(shù)方法，獲得非人靈長類實驗動物的咽鼻部微生物信息數(shù)據(jù)，從而指導(dǎo)飼養(yǎng)、質(zhì)量檢測和疾病防控等。

大量研究表明，在豬、羊、貂、兔等動物中均發(fā)現(xiàn)了PD[14-17]。有文獻資料顯示，導(dǎo)致猴呼吸系統(tǒng)疾病的常見且重要的病原菌為肺炎鏈球菌，死亡率高達82%[18]。鄭振峰等[6]報告猴肺炎鏈球菌是導(dǎo)致呼吸道疾病的第二大病原菌。這些文獻資料的數(shù)據(jù)結(jié)果大多數(shù)是在實驗猴出現(xiàn)臨床癥狀或死亡的樣本中獲得，而在正常恒河猴群體中調(diào)查報告肺炎鏈球菌攜帶情況的文獻較少。據(jù)報告，中國內(nèi)地健康兒童鼻咽部肺炎鏈球菌的攜帶率為21.7%，其中幼兒園兒童（2～5歲）的攜帶率高達25.0%[19]。本研究分別從恒河猴群體的嬰猴、成年猴和老年猴中隨機抽取20只、30只、30只進行肺炎鏈球菌攜帶情況篩查，結(jié)果顯示，20只3～4月齡的嬰猴中有4只的鼻咽部肺炎鏈球菌為陽性，16只為陰性；但4只陽性嬰猴的親代母猴中并未檢測出肺炎鏈球菌。因此，推測本研究中嬰猴所攜帶的肺炎鏈球菌并非經(jīng)垂直傳播，而是自然感染狀態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌有96個血清型[20-22]，其中確定的致病性血清型約20～30種。本次檢測結(jié)果為陽性的嬰猴均未發(fā)生肺炎情況，推測所檢測到的肺炎鏈球菌可能不屬于致病性血清型，也有可能是由于攜帶（定植）載量較低，或者與動物機體抵抗力等因素有關(guān)。因此，本課題組后期將對分離到的肺炎鏈球菌進一步開展血清型鑒定，并跟蹤觀察動物健康狀況。

陳文標(biāo)等[23]和王哲等[24]發(fā)現(xiàn)，不同年齡、不同季節(jié)時人類肺炎鏈球菌感染的分布有一定差異性，但總體而言，小于5歲的兒童和大于50歲的老年人發(fā)病率較高。推測其原因主要是嬰兒剛出生時會從母體獲得一部分免疫力，而3個月后免疫力逐漸喪失，且3個月～2歲的兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，容易受到病原菌感染；老年人由于機體功能逐漸退化，運動減少，多伴有基礎(chǔ)疾病，抵抗力較弱，相對于年輕人更易感染。而本研究結(jié)果顯示，3～4月齡的嬰猴肺炎鏈球菌攜帶率達20%，但在成年猴、老年猴中未檢測到肺炎鏈球菌。推測這可能與環(huán)境和飼養(yǎng)密度有一定關(guān)系。本次研究的嬰猴飼養(yǎng)在飼養(yǎng)室內(nèi)，提供保溫、空氣凈化等設(shè)備，但每個籠內(nèi)飼養(yǎng)2只，動物密切接觸、飼養(yǎng)密度較高等因素可能導(dǎo)致肺炎鏈球菌攜帶率較高；而成年猴和老年猴飼養(yǎng)在室外大籠內(nèi)，飼養(yǎng)密度低、空氣流通和日光中紫外線照射等較好的環(huán)境因素不利于肺炎鏈球菌的定植，另外動物長期接觸同一外界環(huán)境的過程中可能導(dǎo)致微生物菌群發(fā)生適應(yīng)性的變化。需要說明：在生產(chǎn)實踐中老年猴群的肺炎發(fā)病率相對較高，因此尤其要做好確診為肺炎或者因肺炎死亡的病例的病原體檢測、分離和培養(yǎng)，才能積極有效地開展預(yù)防及治療工作。

本次調(diào)查結(jié)合分子生物學(xué)手段和微生物學(xué)手段，對恒河猴群體中肺炎鏈球菌的攜帶情況進行篩查和鑒定，探究不同年齡階段的恒河猴體內(nèi)肺炎鏈球菌的攜帶率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下嬰猴為肺炎鏈球菌的主要攜帶群體，其攜帶率約為20%，該結(jié)果與人類兒童中肺炎鏈球菌的感染情況相近。未來可進一步對所分離到的肺炎鏈球菌進行亞型鑒定和菌株毒理實驗，為肺炎球菌感染的臨床診斷和防治提供進一步的基礎(chǔ)依據(jù)。