姚 婷，高 原，曾芳馨

（1. 成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院內(nèi)分泌科，成都 610051；2. 達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌風(fēng)濕免疫科，達(dá)州 635000）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT），又稱為橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）[1]，是臨床上常見的器官特異性自身免疫性疾病。目前，臨床上廣泛采用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物進(jìn)行治療，上述藥物雖能有效緩解患者癥狀，但會嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體的免疫能力[2]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1/細(xì)胞表面趨化因子受體2 （monocyte chemoattractant protein-1/cell surface chemokine receptor 2，MCP-1/CCR2）信號通路是趨化因子β和CC家族的重要成員，可影響T細(xì)胞在體內(nèi)的分化，而AIT的發(fā)生與T細(xì)胞特別是輔助性T淋巴細(xì)胞（helper T lymphocytes，Th）1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，因此MCP-1/CCR2信號通路影響著AIT的發(fā)生和發(fā)展[3]。

苦參素（matrine）是從傳統(tǒng)藥材苦參（學(xué)名:Sophora flavescens）的根中提取的生物堿，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等多種自身免疫性疾病的自身免疫反應(yīng)過程具有抑制作用[4]。近年來研究表明，苦參素能降低甲狀腺自身抗體，抑制甲狀腺自身免疫反應(yīng)，因而能對AIT發(fā)揮一定療效[5]，然而尚不完全清楚其作用機(jī)制。因此，本實驗通過建立與AIT具有相同病理特征的實驗性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）大鼠模型[5]，探討苦參素對EAT大鼠甲狀腺功能及MCP-1/CCR2信號通路的影響，初步闡述苦參素對EAT可能的作用機(jī)制，進(jìn)而為臨床應(yīng)用苦參素早期干預(yù)AIT提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

6～8周齡SPF級雄性Lewis大鼠75只，購自四川大學(xué)實驗動物中心[SCXK（川）2018-026]，在環(huán)境溫度為（25±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h 循環(huán)光照設(shè)施[SYXK（川）2018-185]中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食?？鄥⑺刈⑸湟海ㄅ? 150422304），0.3 g/mL，購自江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司，以生理鹽水（即0.9% NaCl溶液）稀釋。豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin，pTG）、不完全弗氏佐劑（Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA）、完全弗氏佐劑（completeFreund’s adjuvant，CFA）均購自美國Sigma公司。促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、抗甲狀腺球蛋白抗體（antithyroglobulin antibody，TGAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）檢測試劑盒均購自美國MP Biomedicals公司。干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）、IL-4和IL-10檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物公司。MCP1抗體（ab3827）、CCR2抗體（ab34968）、核因子-κB亞基p65（nuclear facter-κB, subunit p65，NF-κBp65）抗體（ab194856），以及辣根過氧物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgGH&L（ab4091384）和GAPDH抗體-Loading Control（ab33998）均購自英國Abcam 公司。

1.2 動物模型建立[6]

用pH7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）將pTG配制成2 mg/L的溶液，將該溶液與CFA等量混合充分乳化制成油包水乳劑，以0.8 mg/只的劑量，采取背部、腹部多點皮下注射對大鼠進(jìn)行初次免疫。2周和4周后取等體積FIA與pTG溶液進(jìn)行乳化，采取與首次免疫相同的劑量和方式注射，構(gòu)建EAT大鼠模型。造模后大鼠TGAb和TPOAb均明顯升高，說明造模成功。本實驗經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（IACUC-2019-082）。

1.3 動物分組及干預(yù)方法

將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和苦參素低劑量組、中劑量組及高劑量組5組，每組15只。對照組在建立EAT大鼠模型免疫時給予等體積的PBS與CFA；低、中、高劑量組每只大鼠分別灌胃0.2、0.4、0.6 g/kg的苦參素，灌胃體積2 mL；對照組和模型組均給予等體積的生理鹽水，隔日1次，共4周。造模過程中，模型組大鼠死亡3只，苦參素低劑量組死亡1只，苦參素中、高劑量組大鼠各死亡2只，最終各組大鼠均取12只用于后續(xù)實驗。實驗結(jié)束時各組大鼠心臟采血，離心收集血清，－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用體積分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠[2]，取甲狀腺組織，并置于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液中固定。

1.4 甲狀腺組織病理形態(tài)學(xué)檢測

將固定保存的各組大鼠甲狀腺組織依次進(jìn)行脫水，常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm的切片，HE染色，封固后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 ELISA法檢測甲狀腺功能、血清自身抗體和血清細(xì)胞因子

血清中TSH、TGAb、TPOAb以及IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10水平，均采用相應(yīng)ELISA試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測甲狀腺組織中NF-κBp65的表達(dá)

取出經(jīng)10%甲醛溶液固定的甲狀腺組織，經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋、切片后，常規(guī)脫蠟，水化，高壓修復(fù)，然后經(jīng)一抗4 ℃過夜孵育，加稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌。加適量DAB孵育5 min，蘇木精對比染色5 min，無菌水沖洗后，依次用不同濃度的梯度乙醇溶液脫水2h，經(jīng)二甲苯透明，中性樹膠封固。

每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野（×200），在光鏡下連續(xù)觀察10個視野，每個視野內(nèi)計數(shù)200個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率綜合評分。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測甲狀腺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)

采用美國Invent公司的動物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒收集甲狀腺組織中總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品，并進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用含有體積分?jǐn)?shù)5%的BSA的封閉液室溫封閉2 h。加入適當(dāng)稀釋比例的MCP-1和CCR2一抗，于4℃反應(yīng)過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液，曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用±s表示，單因素方差分析用于多組間比較，獨立t檢驗用于兩組間比較；甲狀腺功能和抗體、細(xì)胞因子的關(guān)系采用逐步線性回歸分析；使用GraphPad Prism 5軟件制圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)比較

對照組大鼠有完整的甲狀腺結(jié)構(gòu)，甲狀腺濾泡分布均勻，呈橢圓形或圓形的小葉狀排列，發(fā)育成熟，淡紅色膠質(zhì)均勻分布于濾泡腔內(nèi)，少量血管分布于濾泡周圍間質(zhì)中，未見纖維組織增生（圖1A）。模型組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)遭到不同程度破壞，部分濾泡萎縮甚至消失，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)稀少，間質(zhì)伴灶性淋巴細(xì)胞浸潤以及水腫，纖維組織增生（圖1B）。低、中、高劑量組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)較完整，濾泡大小較一致，上皮細(xì)胞排列趨于規(guī)則，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，水腫減輕，且呈劑量依賴性（圖1C、D、E）。

2.2 甲狀腺功能和血清自身抗體水平

與對照組相比，模型組中TSH、TGAb、TPOAb水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組TSH、TGAb、TPOAb水平均明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖2）。

圖 2 ELISA檢測大鼠甲狀腺功能和血清自身抗體水平Figure 2 Thyroid function and serum autoantibody levels detected by ELISA in each group of rats

2.3 血清細(xì)胞因子水平

與對照組相比，模型組IFN-γ、IL-12水平及IFN-γ/IL-4、IL-12/IL-10均明顯升高（P＜0.05），IL-4、IL-10水平均明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組IFN-γ、IL-12水平及IFN-γ/IL-4、IL-12/IL-10均明顯降低（P＜0.05），IL-4、IL-10水平均明顯升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖3）。

2.4 逐步線性回歸分析

將TSH作為因變量，甲狀腺抗體（TGAb、TPOAb）和細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-10）作為自變量。結(jié)果顯示，抗體和細(xì)胞因子均與TSH呈正相關(guān)性（r2分別為0.786、0.696、0.875、0.855、0.685、0.596，均P＜0.001）。逐步回歸方程決定系數(shù)（R2）=0.897，F(xiàn)=176.495，P＜0.001，方程有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，TGAb、TPOAb、IL-10與TSH有非常顯著性關(guān)系，方程TSH=－3.485+0.203TGAb+0.115TPOAb+0.037 IL-10（均P＜0.001）。

2.5 甲狀腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)

從圖4可見，與對照組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中NF-κBp65蛋白染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率綜合評分均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量組NF-κBp65水平明顯下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖 3 ELISA檢測大鼠血清細(xì)胞因子水平Figure 3 Serum cytokine levels detected by ELISA in each group of rats

圖 4 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠甲狀腺組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)（DAB，×200）及綜合評分Figure 4 NF-κBp65 protein expression detected by immunohistochemistry (DAB，×200) in the thyroid tissues of rats in each group

2.6 甲狀腺組織中MCP-1、CCR2蛋白水平

從圖5可見，與對照組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中MCP-1和CCR2水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量組MCP-1和CCR2水平明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖 5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠甲狀腺組織中MCP-1、CCR2蛋白水平Figure 5 MCP-1 and CCR2 protein levels detected by Western blotting in thyroid tissues of rats in each group

3 討論

AIT是人類較為常見的一種特異性自身免疫性疾病。作為內(nèi)分泌類疾病，AIT也是造成兒童獲得性甲狀腺功能減低的重要原因之一，其發(fā)病率僅次于甲狀腺功能亢進(jìn)癥，在甲狀腺疾病中占比為20%左右[7]。AIT發(fā)病機(jī)制尚不明確，一般認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境或T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起甲狀腺濾泡的破壞有關(guān)[8]，而西醫(yī)臨床尚無有效的治療方案，這也是該病亟需解決的問題。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AIT屬于“癭病”范疇，其發(fā)病與先天稟賦不足、情志內(nèi)傷、飲食及水土失宜有關(guān)，導(dǎo)致氣血運行不暢，氣滯、血瘀、痰凝等壅結(jié)于頸前而引起病發(fā)。中醫(yī)藥在治療AIT上已經(jīng)取得一定的效果[9]?？鄥儆陟铒L(fēng)濕類中藥，有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、消腫止痛等功效，具有良好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等活性；苦參素作為苦參提取物，在如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性腦脊髓炎病等自身免疫性疾病的治療中均取得了滿意效果[10-11]，但其在AIT的研究中報告較少。目前常將EAT動物模型作為研究AIT的重要工具。本實驗通過免疫pTG誘導(dǎo)Lewis大鼠建立EAT動物模型發(fā)現(xiàn)，給予苦參素治療后，大鼠甲狀腺組織病理變化改善明顯，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，炎癥分級降低，血清中TSH、TGAb和TPOAb水平升高幅度下降，且呈劑量依賴性，證實苦參素可減輕AIT，對EAT模型大鼠發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

Th1和Th2細(xì)胞因子在機(jī)體處于正常狀態(tài)下互相調(diào)節(jié)，以保證細(xì)胞免疫和體液免疫維持正常功能[12]。其中Th1通過分泌IFN-γ、IL-12、TNF-α等Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、IL-12作為促炎因子能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞分化、成熟，促進(jìn)B細(xì)胞記憶、抗體分泌[13]。而在EAT中上述炎性因子還可將T細(xì)胞募集到炎癥部位以使甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡加速。Th2細(xì)胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等Th2型抗炎細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫，抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答[14]。據(jù)報告，甲狀腺組織浸潤的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)均有抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)[15]，但其表達(dá)水平隨EAT免疫病程的進(jìn)展逐漸下降。研究證實，在實驗性自身免疫腦脊髓炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等以Th1/Th2類免疫失衡為主的器官特異性自身免疫疾病中，苦參素可增強(qiáng)固有免疫反應(yīng)，在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參素治療后，EAT大鼠IFN-γ/IL-4和IL-12/ IL-10值明顯降低，提示苦參素干預(yù)可能通過下調(diào)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12，上調(diào)Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10，恢復(fù)Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡狀態(tài)，以減輕AIT。逐步回歸分析結(jié)果顯示，TSH與甲狀腺抗體TGAb、TPOAb和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-10均呈正相關(guān)，說明苦參素可通過調(diào)節(jié)EAT大鼠的免疫反應(yīng)保護(hù)其甲狀腺功能。

研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1/CCR2信號通路能夠趨化巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、殺傷T淋巴細(xì)胞等多種炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞，從而參與免疫調(diào)節(jié)作用[17]。MCP-1可由成纖維細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞分泌，對于T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用；而CCR2廣泛表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等單核細(xì)胞上，是G蛋白的偶聯(lián)受體。文獻(xiàn)報告稱，MCP-1在AIT患者甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中明顯高于正常水平[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者相比，手術(shù)切除的AIT患者甲狀腺組織經(jīng)過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)CCR2的表達(dá)水平明顯升高[19]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為MCP-1/CCR2信號通路下游啟動炎性因子的靶因子，正常情況下以NF-κB抑制蛋白激酶復(fù)合體的形式存在；在組織損傷誘發(fā)炎性反應(yīng)時，NF-κB在酶的作用下發(fā)生解離，導(dǎo)致促炎性因子大量表達(dá)[20]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)苦參素治療后，MCP-1、CCR2和NFκBp65蛋白水平明顯下降，提示苦參素可通過下調(diào)MCP-1/CCR2信號通路及下游NF-κBp65蛋白表達(dá)，有效減輕炎性反應(yīng)細(xì)胞的聚集，發(fā)揮對EAT的治療作用。

綜上所述，苦參素能抑制甲狀腺抗體生成，下調(diào)Th1型細(xì)胞因子，上調(diào)Th2型細(xì)胞因子，進(jìn)而降低Th1/Th2值，并抑制MCP-1/CCR2信號軸，發(fā)揮對EAT的保護(hù)作用。