吳志浩，沈 宸，殷 俊，朱立麒，張 泉,2

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；2．揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院，揚(yáng)州 225001)

肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus，H.h）是一種革蘭陰性菌，在某些易感小鼠品系中感染率較高，可引起肝臟和腸道疾病[1]，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型構(gòu)建能造成一定影響。炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種復(fù)雜的腸道疾病，可分為克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，罹患這兩類(lèi)IBD后患者通常因腸道長(zhǎng)期過(guò)度的炎性反應(yīng)出現(xiàn)便血和體質(zhì)量減輕[2]。已知白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10）敲除（IL-10-/-）小鼠能夠感染H.h并引起結(jié)腸炎[3]，常用于結(jié)腸炎模型的建立。使用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可作為IBD的疾病模型[4]。然而處于非無(wú)菌環(huán)境中的小鼠可能因感染H.h而對(duì)結(jié)腸炎模型造成一定影響。本研究旨在用DSS誘導(dǎo)感染H.h的小鼠制備IBD模型，探究H.h感染對(duì)DSS慢性結(jié)腸炎模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株

IL-10-/-小鼠（B6.129P2-IL10tmlCgn/J）購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心SPF級(jí)動(dòng)物設(shè)施[SYXK（蘇）2017-0044]。環(huán)境溫度（26±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，晝夜12h更替。實(shí)驗(yàn)前小鼠H.h檢測(cè)均呈陰性。H.h（ATCC51449）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

DSS購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；蘇木精和伊紅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScript RT Regent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自日本TAKARA公司；Universal SYBR Green Master購(gòu)自瑞士Roche公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化STAT3（phosphorylation-STAT3，p-STAT3）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；超敏化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立

5周齡雄性IL-10-/-小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組、DSS組、H.h組和H.h+DSS組。H.h組和H.h+DSS組各10只小鼠使用H.h標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51449菌液0.2 mL（1×109CFU/mL）進(jìn)行3次灌胃，每次灌胃間隔1 d，最后一次灌胃后5 d經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）快速檢測(cè)證明20只小鼠均已感染H.h[5]。在H.h組和H.h+DSS組確認(rèn)感染后，DSS組和DSS+H.h組小鼠飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的DSS溶液2個(gè)周期，每個(gè)周期7 d；2個(gè)周期間隔，飲用無(wú)菌水5d。對(duì)照組和H.h組均正常飲用無(wú)菌水。觀察小鼠及其糞便狀態(tài)，并記錄小鼠體質(zhì)量變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)取材

小鼠經(jīng)脫頸椎處死后，分離小鼠結(jié)腸，并用游標(biāo)卡尺（精度0.05mm）測(cè)量長(zhǎng)度。取結(jié)腸近端1/3用于制作病理切片，中端及遠(yuǎn)端均分后分別用于提取相關(guān)mRNA和蛋白。

1.5 病理學(xué)檢查

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定結(jié)腸組織后，梯度乙醇溶液脫水，2次100%正丁醇透明各1 h，然后于60 ℃烘箱中浸蠟30 min，并進(jìn)行包埋。連續(xù)切片，切片厚度為5μm。然后分別進(jìn)行HE染色與Masson染色。按照組織病理學(xué)活動(dòng)指數(shù)（histological activity index，HAI）進(jìn)行評(píng)分（表1），比較各組病變差異。

表 1 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)活動(dòng)指數(shù)評(píng)分表Table 1 Grading scheme of the histological activity index (HAI) in the colon of mice

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)腸相關(guān)炎性因子轉(zhuǎn)錄水平

提取結(jié)腸總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，總計(jì)40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 20 s。PCR引物序列包括：GAPDH上游引物為5'-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物為5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'；IL-6上游引物為5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，下游引物為5'-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；TNF-α上游引物為5'-AACTAGTGGTGCCAGCCGAT-3'，下游引物為5'-CTTCACAGAGCAATGACTCC-3'。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)STAT3蛋白表達(dá)水平

RIPA法提取結(jié)腸組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白用10%分離膠進(jìn)行SDSPAGE分離。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶溶液進(jìn)行封閉，分別使用稀釋比例為1︰1 000的β-actin、STAT3、p-STAT3一抗孵育過(guò)夜，再用稀釋比例為1︰10 000的二抗孵育1 h，使用超敏化學(xué)發(fā)光試劑顯影。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用Graphpad 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，并進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差分析；組織切片參考Two-way ANOVA系統(tǒng)評(píng)級(jí)評(píng)分。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.h感染可加重DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎

DSS組和DSS+H.h組在飲用DSS水7 d后小鼠體質(zhì)量降低，活動(dòng)性下降，有輕微便血?；謴?fù)正常飲水后，DSS組小鼠體質(zhì)量小幅回升；而DSS+H.h組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，精神萎靡，腹瀉，便血。再次飲用DSS水后，DSS和DSS+H.h組均出現(xiàn)更明顯的體質(zhì)量下降（表2）、腹瀉與便血。H.h組和對(duì)照組小鼠體質(zhì)量保持穩(wěn)定小幅上升，且精神狀態(tài)良好，無(wú)腹瀉和血便。H.h組和對(duì)照組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度無(wú)變化，DSS和DSS+H.h組結(jié)腸長(zhǎng)度均縮短，且DSS+H.h組縮短情況更明顯（表2）。

表 2 各組小鼠體質(zhì)量變化和結(jié)腸長(zhǎng)度Table 2 Body weight of mice and their colon length in diffrent groups( ± s，n=10)

表 2 各組小鼠體質(zhì)量變化和結(jié)腸長(zhǎng)度Table 2 Body weight of mice and their colon length in diffrent groups( ± s，n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與DSS組比較，△P<0.05。

組別 體質(zhì)量/mg 結(jié)腸長(zhǎng)度/cm 實(shí)驗(yàn)前 飲用DSS水7 d 正常飲水5 d 再次引用DSS水7 d對(duì)照組H.h組DSS組H.h+DSS組21.892±1.207 21.962±1.614 21.716±1.472 22.056±0.947 22.870±1.067 23.134±1.204 21.136±0.676*21.156±0.947*23.606±1.018 23.767±1.340 21.186±1.194*19.954±1.415*△24.125±0.941 24.333±1.473 19.650±1.755*17.809±1.616*△7.494±0.078 7.514±0.053 6.446±0.111*4.760±0.154*△

2.2 H.h感染可加重DSS慢性結(jié)腸炎小鼠病變

與對(duì)照組（圖1A）相比，H.h組有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛完整，杯狀細(xì)胞無(wú)缺失（圖1B）。DSS組小鼠結(jié)腸固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩結(jié)構(gòu)改變，部分隱窩擴(kuò)張、扭曲，腸腺減少（圖1C）。H.h+DSS組黏膜全層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且延伸至黏膜下層，正常隱窩結(jié)構(gòu)消失（圖1D）。HAI評(píng)分（表3）表明，H.h主要通過(guò)促進(jìn)炎性反應(yīng)、上皮缺失、隱窩萎縮和增生，加劇DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎。

表 3 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)活動(dòng)指數(shù)評(píng)分Table 3 The histological activity index (HAI) score of the colon tissues of mice( ± s，n=10)

表 3 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)活動(dòng)指數(shù)評(píng)分Table 3 The histological activity index (HAI) score of the colon tissues of mice( ± s，n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DSS組比較，△P<0.05。

分 組 炎性反應(yīng) 上皮缺失 腺體萎縮 增生對(duì)照組H.h組DSS組H.h+DSS組 0 0.8±0.422*1.7±0.483*2.9±0.316**△ 0 0.4±0.309 1.7±0.483*2.8±0.422**△ 0 0.5±0.516 2.0±0.667*3.1±0.316**△ 0 0.6±0.516 2.6±0.667*3.5±0.527**△

2.3 H.h感染可加重DSS慢性結(jié)腸炎小鼠纖維化程度

Masson染色可用于指示膠原纖維沉積程度，能用藍(lán)色和紅色區(qū)分膠原纖維和肌纖維，因此常應(yīng)用于腸纖維化的觀察[6]。對(duì)照組和H.h組僅在黏膜下層有少量膠原纖維沉積（圖2A、2B）；DSS組中纖維沉積已出現(xiàn)在固有層（圖2C）；H.h+DSS組黏膜下層纖維沉積更為嚴(yán)重，黏膜層全層纖維沉積，且范圍更大（圖2D）。

圖 1 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 (HE染色，×100)Figure 1 Pathological observation of the colon tissues of mice (HE staining, ×100)

圖 2 小鼠結(jié)腸組織Masson染色(×100)Figure 2 Masson’s trichrome staining of the colon tissues of mice (×100)

2.4 H.h感染可增加DSS慢性結(jié)腸炎小鼠組織中炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果如圖3A所示。與對(duì)照組比較，H.h感染促進(jìn)了IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）。在DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎中，IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)（P＜0.01），而H.h+DSS組的IL-6和TNF-α轉(zhuǎn)錄水平比DSS組明顯升高（P＜0.05），提示H.h感染促進(jìn)了DSS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)（表4）。

表 4 小鼠結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Table 4 Transcriptional levels of IL-6 and TNF-α in the colon tissues of mice( ± s，n=10)

表 4 小鼠結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Table 4 Transcriptional levels of IL-6 and TNF-α in the colon tissues of mice( ± s，n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與DSS組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

分組 IL-6 TNF-α對(duì)照組H.h組DSS組H.h+DSS組 1.087±0.180 5.765±2.304*24.251±1.644**32.073±3.307**△ 1.044±0.117 3.737±0.371* 6.663±0.469**11.702±0.282**△△

2.5 H.h感染可激活DSS慢性結(jié)腸炎組織中STAT3磷酸化水平

JAK-STAT3通路是炎性反應(yīng)中IL-6、TNF-α等炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)因子[7]。如圖3B所示，DSS組中的STAT3被激活，而H.h+DSS組中的STAT3則被大量激活，提示H.h感染顯著增強(qiáng)了DSS慢性結(jié)腸炎組織中STAT3磷酸化程度，說(shuō)明感染H.h可以加劇DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。

圖 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測(cè)小鼠腸道組織中相關(guān)分子表達(dá)Figure 3 Detection of relative molecular expression in the colon tissues of mice by real-time fluorescent quantitative PCR (A) and Western blotting (B)

3 討論

21世紀(jì)以來(lái)，人類(lèi)IBD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，許多國(guó)家IBD的患病率達(dá)0.3%以上[8]。目前IBD的發(fā)病機(jī)制仍未明確。一些研究結(jié)果表明，細(xì)胞因子和趨化因子、腸道微生物、遺傳和環(huán)境因素等參與了IBD的發(fā)病[9-12]。動(dòng)物模型在IBD的發(fā)病機(jī)制及治療手段研究中發(fā)揮重要作用。目前通常使用DSS、三硝基苯磺酸和H.h等化學(xué)或生物方法建立小鼠IBD模型。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群對(duì)小鼠的免疫系統(tǒng)有著一定的調(diào)節(jié)作用，如激活炎性因子釋放和激活免疫細(xì)胞[13-14]；而不同飼養(yǎng)環(huán)境中的小鼠腸道菌群有所差異，導(dǎo)致構(gòu)建疾病模型時(shí)小鼠免疫狀態(tài)不同。H.h在易感小鼠中能夠引起慢性活動(dòng)性肝炎、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌及IBD[7]。感染H.h的小鼠用于構(gòu)建肝臟、腸道疾病模型時(shí)容易引起誤差，因此在進(jìn)行該類(lèi)研究時(shí)控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)質(zhì)量尤其重要。

促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α等在結(jié)腸炎性反應(yīng)期間的失調(diào)會(huì)損害腸黏膜，在IBD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[15]。IL-6能夠影響細(xì)胞的增殖、存活、分化與轉(zhuǎn)移[16]。TNF-α通過(guò)促進(jìn)黏附分子如血管細(xì)胞黏附因子-1和細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，顯著增加腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[17]。STAT3能被多種因子激活，如IL-6和TNF-α，進(jìn)而導(dǎo)致大量炎性因子表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與增殖，參與炎性反應(yīng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，H.h感染影響了DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎模型小鼠的生理指標(biāo)和病理變化；在構(gòu)建結(jié)腸炎模型時(shí)，H.h感染促進(jìn)了淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子釋放，并進(jìn)一步激活了炎性反應(yīng)關(guān)鍵信號(hào)STAT3，提高了DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎發(fā)病過(guò)程中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度，說(shuō)明感染H.h的小鼠會(huì)影響動(dòng)物模型尤其是結(jié)腸炎模型的建立及評(píng)價(jià)，提示了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的重要性。

綜上所述，在構(gòu)建IBD模型時(shí)，H.h通過(guò)促進(jìn)炎性因子表達(dá)，激活STAT3通路而造成更加嚴(yán)重的結(jié)腸炎；這對(duì)研究IBD發(fā)病進(jìn)程及評(píng)價(jià)帶來(lái)一定影響。