李娜 連續(xù) 蘭宏偉 許紅昕

[摘要] 目的 通過生物信息學(xué)的方法分析溶血磷脂酸受體5（LPAR5）在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達(dá)及臨床意義，為PTC分子生物研究和生物標(biāo)志物篩選提供理論依據(jù)。 方法 2020年5月開始從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選數(shù)據(jù)，最終篩選出編號為GSE3678的基因芯片，并對樣本進(jìn)行規(guī)范化處理，篩選出差異表達(dá)基因LPAR5。利用TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證LPAR5在甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織差異表達(dá)情況，同時(shí)在ulcan數(shù)據(jù)庫分析LPAR5表達(dá)與PTC患者臨床特征之間的關(guān)系。通過GEPIA2分析LPAR5基因與甲狀腺癌生存率之間的關(guān)系。 結(jié)果 共篩選出甲狀腺癌差異基因755個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)差異基因314個(gè)，表達(dá)下調(diào)差異基因441個(gè)，基于TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析得出LPAR5在甲狀腺癌中表達(dá)高于正常甲狀腺組織，LPAR5表達(dá)量與甲狀腺癌患者的臨床分期和N分期密切相關(guān)（P<0.05），而與性別、年齡未見相關(guān)性（P>0.05），GEPIA2分析顯示甲狀腺癌患者LPAR5高表達(dá)組總生存率高于低表達(dá)組（P<0.05），而在甲狀腺癌患者無病生存期中LPAR5高表達(dá)組與低表達(dá)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 本研究通過生物信息學(xué)分析得到了甲狀腺癌中的部分差異基因，并通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析進(jìn)一步驗(yàn)證了LPAR5在甲狀腺癌中的高表達(dá)，且與腫瘤臨床分期和N分期密切相關(guān)，進(jìn)一步證明了LPAR5可能參與PTC的發(fā)生發(fā)展，并影響PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌;LPAR5;生物信息學(xué);GEO;TCGA;GEPIA2

[中圖分類號] R736.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）09-0001-04

The expression and significance of LPAR5 in papillary thyroid carcinoma based on bioinformatics

LI Na1? ?LIAN Xu1? ?LAN Hongwei2? ?XU Hongxin1

1.Department of Endocrinology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157000， China; 2.Department of Oncology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157000， China;

[Abstract] Objective To analyze the expression and clinical significance of lysophosphatidic acid receptor 5 （LPAR5） in papillary thyroid carcinoma（PTC） by means of bioinformatics， so as to provide a theoretical basis for PTC molecular biology research and biomarker screening. Methods The data from the GEO database from May 2020 were screened. Finally the gene chip numbered GSE3678 was screened out. The samples were and standardized to screen out the differentially expressed gene LPAR5. The TCGA database was used to verify the differential expression of LPAR5 in thyroid cancer tissues and normal thyroid tissues. The relationship between the LPAR5 expression and clinical characteristics of PTC patients was analyzed in the ulcan database. The relationship between the LPAR5 gene and thyroid cancer survival rate was analyzed by GEPIA2. Results A total of 755 differential genes in thyroid cancer were screened， including 314 upregulated differentially expressed genes and 441 downregulated differentially expressed genes. Based on the analysis of TCGA gene expression data，it was concluded that the expression of LPAR5 in thyroid cancer was higher than that in normal thyroid tissue. The expression of LPAR5 was closely related to the clinical stage and N stage of thyroid cancer patients （P<0.05）， but had no correlation with gender and age（P>0.05）. GEPIA2 analysis showed that the overall survival rate of patients with thyroid cancer in the LPAR5 high expression group was higher than that in the low expression group（P<0.05）， while there was no significant difference between the LPAR5 high expression group and the low expression group in the disease-free survival of patients with thyroid cancer（P>0.05）. Conclusion This study obtained some differential genes in thyroid cancer through bioinformatics analysis， and further verified the high expression of LPAR5 in thyroid cancer through TCGA database analysis， and was closely related to the clinical stage and N stage of the tumor， which further proved that LPAR5 might be involved in the occurrence and development of PTC and affect PTC lymph node metastasis.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; LPAR5; Bioinformatics; GEO; TCGA; GEPIA2

甲狀腺癌是內(nèi)分泌最常見的惡性腫瘤，從全球范圍來看，過去的30年甲狀腺癌的發(fā)病率增長了300%[1]，是所有實(shí)體惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在30歲以下的女性中，甲狀腺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第一位[2]。甲狀腺癌主要包括四種病理類型：甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）、甲狀腺濾泡狀癌（Follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）、甲狀腺髓樣癌（Medullary thyroid carcinoma，MTC）和甲狀腺未分化癌（Anaplastic thyroid carcinoma，ATC），其中PTC和FTC起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞統(tǒng)稱為分化型甲狀腺癌。PTC是最常見的甲狀腺癌，約占所有甲狀腺癌的85%。甲狀腺癌早期起病隱匿，且早期確診率并不高，致使患者錯(cuò)失了最佳的治療時(shí)期，隨著病程進(jìn)展會(huì)侵犯周圍神經(jīng)出現(xiàn)聲音嘶啞、吞咽困難和呼吸困難等，并出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移。甲狀腺癌的治療方法較為單一，目前大都采取手術(shù)切除的方法，但術(shù)后還需要進(jìn)一步的放射碘治療和終身服藥，這在一定程度上增加了患者的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。數(shù)據(jù)顯示我國甲狀腺癌5年相對生存率為67.5%[3]，其死亡率也隨著發(fā)病率的增加逐年增加。因此，尋找甲狀腺癌早期診斷的標(biāo)志物以及靶向藥物開發(fā)的潛在基因至關(guān)重要。

溶血磷脂酸受體5（Lysophosphatidic acid receptor 5，LPAR5）屬于嘌呤能受體家族中的非內(nèi)皮細(xì)胞分化基因受體，它是通過針對獨(dú)立的G蛋白偶聯(lián)受體92蛋白抗體的篩選方法被鑒定的第5個(gè)溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）受體。人類LPAR5位于染色體12p13.31上，并編碼一種由372個(gè)氨基酸組成的41 kDa的蛋白[4]。LPAR5分布較為廣泛，在小腸、皮膚、肝、肺、胸腺中均有表達(dá)。在腫瘤組織中，LPAR5常過度表達(dá)，例如LPAR5在乳腺癌、胰腺癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且能激活腫瘤并發(fā)揮促癌作用[5-6]。LPAR5在甲狀腺癌中的報(bào)道較少見，但Wu等[7]在實(shí)驗(yàn)中證明LPAR5可以促進(jìn)PTC的轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生，并且可以影響細(xì)胞的侵襲和遷移。在此背景下，本文希望通過生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步了解LPAR5在PTC中的表達(dá)情況以及LPAR5與PTC臨床特征之間的關(guān)系，并探討LPAR5的表達(dá)對PTC患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

登錄公共基因芯片數(shù)據(jù)庫（Gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，選取符合條件的基因芯片GSE 3678，獲得差異表達(dá)基因。登錄癌癥和腫瘤基因圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/），下載甲狀腺癌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)RNA-Seq數(shù)據(jù)， 登錄ulcan數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）（此數(shù)據(jù)庫沒有中英文全稱），分析LPAR5與甲狀腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系。利用在線網(wǎng)站基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）分析LPAR5與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 GEO數(shù)據(jù)集的選擇? 在GEO數(shù)據(jù)庫檢索界面中輸入篩選條件：（a）thyroid tumor or thyroid cancer;（b）samples containing tumor and normal thyroid tissues;（c）Homo sapiens as the organism;（d）cancer type：Papillary thyroid cancer，在以上篩選條件下，選取含有PTC樣本且通過芯片質(zhì)量要求的基因芯片GSE3678?；蛐酒畔ⅲ篈ffymetrix human genome U133 plus 2.0 array，平臺為GPL570，共包含7個(gè)正常甲狀腺組織，7個(gè)PTC組織。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因的篩選? 在GEO中獲得芯片GSE3678基因表達(dá)矩陣以及平臺注釋信息，然后用R語言的limma等軟件包對測序平臺的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，評估芯片質(zhì)量并標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行差異基因篩選，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)：修正后的P值<0.05，（adjust P.Value<0.05），表達(dá)變化倍數(shù)大于2（|log2 FOLD CHANGE（FC） |>1），獲得差異表達(dá)基因（limma）。

1.2.3 TCGA數(shù)據(jù)集篩選和處理? 在TCGA數(shù)據(jù)庫中設(shè)定如下篩選條件： Files版塊：Data Category：Transcriptome Profiling;Date Type：Gene Expression Quantification;Experimental Strategy：RNA-Seq;Workflow Type：HTSeq-FPKM，其余默認(rèn)系統(tǒng)選項(xiàng)。CASE版塊：Primary Site：Thyroid gland，其余默認(rèn)系統(tǒng)選項(xiàng)。共獲取基因表達(dá)樣本568例，其中癌組織樣本510例，癌旁正常甲狀腺組織樣本58例。通過R語言及Perl語言整理基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并分析LPAR5在甲狀腺癌組織和癌旁正常甲狀腺組織差異表達(dá)情況。

1.2.4 ulcan數(shù)據(jù)庫探討LPAR5與甲狀腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系? 在ulcan數(shù)據(jù)庫中設(shè)定如下篩選條件：（a）在數(shù)據(jù)庫首頁選擇TCGA analysis;（b）Enter gene symbol（s）：LPAR5;（c）TCGA dataset：Thyroid carcinoma;（d）Links for analysis：Expression。分析甲狀腺癌中LPAR5基因在年齡、性別、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等方面的表達(dá)差異。

1.2.5 GEPIA2分析LPAR5與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系? 登錄GEPIA2設(shè)置主要篩選條件如下：（a）Gene symbol：LPAR5;（b）FUNCTIONS：Survival Analysis;（c）Datasets Selection（Cancer name）：THCA（d）Methods：Overall Survival、Disease Free Survival;（e）Group Cutoff：Median。設(shè)置完畢后，提交檢索。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察甲狀腺癌差異基因表達(dá)情況，并且比較LPAR5在甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況及其與臨床特征和生存預(yù)后之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，兩組獨(dú)立樣本等級資料比較采用Wilcoxon 兩樣本秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)的處理結(jié)果

利用pheatmap、FactoMineR等R包對基因芯片GSE3678進(jìn)行評估，并得到芯片樣本表達(dá)譜箱線圖（封三圖1A）及全基因表達(dá)聚類熱圖（封三圖1C）。結(jié)果顯示，此數(shù)據(jù)未經(jīng)過log2轉(zhuǎn)化處理，且各表達(dá)譜芯片中位數(shù)不在同一水平，存在差異，不能直接進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，需要規(guī)范化處理。應(yīng)用R語言的limma軟件包對芯片原始數(shù)據(jù)樣本進(jìn)行二次分析、背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理后，將各表達(dá)譜中位數(shù)置于同一水平（封三圖 1B），消除分析過程存在的非實(shí)驗(yàn)誤差（pheatmap、Facto MineR limma）。

2.2 PTC與正常甲狀腺組織的差異基因篩選結(jié)果

通過limma包進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，共獲得755個(gè)差異基因，其中314個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，包括：突出結(jié)合素5（Synaptotagmin like 5，SYTL5）、LDL受體相關(guān)蛋白4（LDL receptor related protein 4，LRP4）、二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、LPAR5等?；虮磉_(dá)下調(diào)有441個(gè)，包括內(nèi)皮素3（Endothelin 3，EDN3）、碘甲狀腺素脫碘酶1（Iodothyronine deiodinase 1，DIOI）、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白1（Cellular retinoic acid binding protein 1，CRABP1）等。繪制差異基因火山圖（封三圖 2A）。根據(jù)log2FC進(jìn)行排序后，進(jìn)一步利用熱圖呈現(xiàn)變化差異最大的前30個(gè)上調(diào)及下調(diào)的基因（封三圖 2B）。選取在甲狀腺癌中研究較少的LPAR5做進(jìn)一步分析。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中LPAR5的表達(dá)情況

使用 R 語言和Perl語言分析整理數(shù)據(jù)，并繪制 LPAR5在甲狀腺癌與正常甲狀腺組織中的表達(dá)散點(diǎn)圖。與對照組相比，甲狀腺癌組織中LPAR5呈顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見封三圖3A。同時(shí)配對的58例甲狀腺癌與癌旁正常甲狀腺組織中LPAR5表達(dá)也有明顯的差異，其在甲狀腺癌組織中顯著高表達(dá)（P<0.001）。見封三圖3B。

2.4 LPAR5與甲狀腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系

根據(jù)ulcan數(shù)據(jù)庫檢索源自TCGA數(shù)據(jù)庫中的505例甲狀腺癌患者的臨床資料（由于部分患者臨床資料—相對不完整，導(dǎo)致各組間總數(shù)具有差異）。見表1。分析甲狀腺癌中LPAR5基因在年齡、性別、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等方面的表達(dá)差異（封三圖4）。不同臨床分期的患者LPAR5表達(dá)量不同，且未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者的LPAR5表達(dá)低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在針對不同的性別、年齡的甲狀腺癌患者中，LPAR5的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5 GEPIA2分析LPAR5與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA2分析LPAR5表達(dá)與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，以樣本中LPAR5表達(dá)的中位數(shù)作為分界點(diǎn)，分為高表達(dá)組及低表達(dá)組，我們發(fā)現(xiàn)LPAR5高表達(dá)組甲狀腺癌患者總生存率高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖5A。而在甲狀腺癌患者無病生存期中LPAR5高表達(dá)組與低表達(dá)組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見封三圖5B。

3 討論

甲狀腺癌有多種病理類型，其中PTC是甲狀腺癌中最為常見的病理類型，雖然死亡率較低，但是針對PTC分子生物研究，并且有針對性的治療也是非常必要的。利用生物信息學(xué)分析癌癥特異性基因表達(dá)可能為人類癌癥的治療提供一個(gè)新的基礎(chǔ)。探索腫瘤的標(biāo)志物，提高其診斷的準(zhǔn)確度及靈敏度，評估病情和腫瘤的預(yù)后，進(jìn)行相關(guān)的靶向治療等，都將會(huì)成為今后的研究方向。本研究通過分析LPAR5在PTC中的表達(dá)情況及其與臨床體征之間的關(guān)系，來預(yù)測其可能成為未來PTC診斷的分子標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)。

LPA是一種小甘油磷脂，目前已知有6種LPA受體亞型，由于受體亞型、表達(dá)模式和效應(yīng)通路的異質(zhì)性，LPA的作用也是多樣和廣泛的，其參與人體多種生物系統(tǒng)如：神經(jīng)系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，同時(shí)還參與了一些疾病過程，如呼吸道疾病、癌癥、肥胖、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)損傷[8]，其在不同的系統(tǒng)和疾病中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)著許多生物學(xué)過程。

LPA信號調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的惡性特性主要是通過依賴LPA受體的表達(dá)和功能改變所導(dǎo)致的，其在癌癥中通過促進(jìn)血管生成、增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移來驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展[9]，但其促腫瘤的作用似乎是在受體表達(dá)水平上調(diào)控，而不是配體濃度水平上調(diào)控。然而每個(gè)受體亞型根據(jù)不同疾病的癌細(xì)胞其表現(xiàn)的生物學(xué)特性各不相同。LPA的不同亞型在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。研究表明，溶血磷脂酸受體1（Lysophosphatidic acid receptor 1，LPAR1）和溶血磷脂酸受體2（Lysophosphatidic acid receptor 2，LPAR2）通過介導(dǎo)LPA誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞、胃腸道癌癥的遷移和侵襲[10-11]。Xia等[12]在實(shí)驗(yàn)中證明了溶血磷脂酸受體3（Lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）可增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，這對甲狀腺癌的進(jìn)展起到促進(jìn)作用[12]。此外，Pan等[13]還發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂酸受體4（Lysophosphatidic acid receptor 4，LPAR4）為PTC的驅(qū)動(dòng)基因，并強(qiáng)調(diào)LPAR4可以作為PTC潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。此前，也有一些研究表明在不同免疫細(xì)胞類型中抑制LPAR5可能會(huì)增強(qiáng)抗腫瘤的活性并且抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9]，這一點(diǎn)在乳腺癌中得到了很好的驗(yàn)證[5]。然而在鼻咽癌和人類肉瘤細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)LPAR5起著負(fù)向調(diào)控的作用，其下調(diào)時(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[14-15]，因此，LPAR5在癌細(xì)胞中具體的生物學(xué)作用不能一概而論。

本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出755個(gè)差異基因，選取其中高表達(dá)的LPAR5做進(jìn)一步分析。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析進(jìn)一步驗(yàn)證了LPAR5在PTC中的高表達(dá)，這與之前Liu等[16]的研究結(jié)果一致。本研究還進(jìn)一步探討了LPAR5與臨床特征間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LPAR5的表達(dá)與年齡和性別等因素?zé)o直接相關(guān)性，但與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，LPAR5與甲狀腺癌患者的總生存率呈正相關(guān)，但是，這與之前LPAR5在甲狀腺癌中對患者生存率影響的結(jié)果相矛盾[7]。然而，利用生物信息學(xué)分析也存在一定局限性，缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為支持驗(yàn)證，因此也可以從臨床角度進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證LPAR5與甲狀腺腫瘤之間的關(guān)系，也可以從基礎(chǔ)角度分析敲低LPAR5后對甲狀腺腫瘤細(xì)胞的影響。所以說LPAR5在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體功能和作用機(jī)制仍有待探索，還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，通過使用GEO數(shù)據(jù)庫和在線數(shù)據(jù)庫分析平臺，不僅在甲狀腺癌中識別了一些差異顯著的基因，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)LPAR5在甲狀腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，證明了LPAR5可能參與PTC的發(fā)生發(fā)展，并且影響著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有預(yù)測甲狀腺癌風(fēng)險(xiǎn)度的潛能。本研究結(jié)果可以在一定程度上為甲狀腺癌提供潛在的、可靠的生物標(biāo)志物，對進(jìn)一步應(yīng)用于甲狀腺癌的臨床診斷、預(yù)后和靶向治療提供了新思路。

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（收稿日期：2020-11-06）