田學(xué)鳳，姚堯，湯一

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058）

普洱茶是云南特有名茶，主要產(chǎn)于云南西雙版納、普洱、臨滄等地區(qū)[1]。根據(jù)其品質(zhì)特征和加工工藝的差異，普洱茶可分為普洱生茶與普洱熟茶2類[2]。其中，普洱生茶因其陳化生香的品質(zhì)特點[3-4]與抗氧化、清除自由基[5-7]等功效，成為茶葉市場的一大消費熱點。普洱生茶是由普洱原料茶（云南曬青毛茶）不進行渥堆工序、直接自然陳化而制成的，其新茶品質(zhì)與綠茶較接近，茶性較為刺激。隨著貯藏時間延長和茶葉陳化程度加深，茶性轉(zhuǎn)為溫和，口感更為醇和爽滑，滋味更為圓潤甘甜[7-8]。因此，貯藏對于普洱茶品質(zhì)的形成與轉(zhuǎn)化具有重要意義。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，普洱原料茶中有大量的內(nèi)生菌，且普洱熟茶渥堆過程中的微生物大多來自于茶葉內(nèi)生菌、茶葉生長環(huán)境和茶葉加工車間[9]。在普洱茶中發(fā)現(xiàn)的微生物類群主要包括青霉屬、曲霉屬、酵母菌和細菌等[10]。然而，關(guān)于微生物對普洱茶品質(zhì)的作用研究，大多著眼于普洱熟茶的渥堆過程[11-14]，有關(guān)普洱生茶在貯藏過程中發(fā)生品質(zhì)轉(zhuǎn)變的原因尚無定論，目前存在的主要說法有殘余酶作用、微生物作用、化學(xué)氧化作用或它們之間的共同作用。本文旨在比較代表輻射化學(xué)氧化的輻照處理與代表生物氧化的微生物在普洱生茶陳化過程中的作用，試圖解釋陳化過程中普洱生茶的品質(zhì)轉(zhuǎn)化機制，為進一步優(yōu)化普洱生茶貯藏條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試普洱生茶樣品于2017 年4 月產(chǎn)自云南省臨滄市鎮(zhèn)康縣，產(chǎn)品規(guī)格200 g/餅。

氫氧化鈉（NaOH，≥99%）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、酒石酸甲鈉（C4H4KNaO6）、硫酸亞鐵（FeSO4）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1種沒食子酸、8種兒茶素單體和3種生物堿單體的標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜純級乙腈、甲醇、甲酸購自美國Tedia 公司；七水合硫酸亞鐵、十二水合磷酸氫二鈉、（D＋）-葡萄糖、二水合氯化亞錫購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

DL-WS210 型溫濕度記錄儀（杭州盡享科技公司）；BSA124S-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省常州市國華電器有限公司）；HH-1J型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SIGMA-3K15 型離心機（德國Sigma 公司）；HWS-250 型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱（浙江省寧波市賽福實驗儀器有限公司）；LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2802S 型紫外分光光度計（美國Unico 公司）；高能電子直線加速器（浙江省紹興市華能電子加速器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理

開展3因素試驗。

1）輻照劑量。0 kGy（未輻照）（A1）；5 kGy（A2）；9 kGy（A3）。采用高能電子直線加速器進行輻照，輻照時間30 s，電子線掃描寬度800～1 000 mm，－5.5%≤掃描不均度≤5.5%，－2.0%≤能量不穩(wěn)定度≤2.0%，－2.0%≤束流強度不穩(wěn)定度≤2.0%。

2）貯藏環(huán)境。在浙江大學(xué)茶葉研究所茶葉審評實驗室內(nèi)室溫貯藏（B1）；在70%相對濕度＋30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)貯藏（B2）。

3）染菌處理。樣品用鋁箔袋密封包裝后經(jīng)不同輻照劑量滅菌，不拆封貯存，保持與外界空氣隔離的無菌狀態(tài)（C1）；經(jīng)不同輻照劑量滅菌后拆封，裸露茶樣于空氣中26 h，染菌后再重新密封（C2）。

將上述3 因素試驗進行組合，共有A1B1、A1B2、A2B1C1、A2B1C2、A2B2C1、A2B2C2、A3B1C1、A3B1C2、A3B2C1、A3B2C2等10 個處理，各處理茶樣均分為6份，每份100 g，用統(tǒng)一的鋁箔袋包裝。在分別貯藏0、30、75、120、165、200 d后取樣并進行成分檢測。

1.2.2 微生物檢測方法

1）樣品前處理。準(zhǔn)確稱取茶樣0.5 g，放入裝有9.5 mL無菌水的三角瓶中，放置搖床上振蕩2 h后，取出，靜置20 min，重復(fù)1次平行試驗。用微量移液槍吸取預(yù)處理的上清液1 mL，加無菌水，按10－1、10－2、10－3進行梯度稀釋。

2）微生物的計數(shù)。分別取普洱生茶樣品10－1、10－2、10－3稀釋勻液各50 μL，加入到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和麥?zhǔn)檄傊囵B(yǎng)基上進行涂布，分別于適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長出，然后選擇涂布平板上單菌落數(shù)量適中的平板進行計數(shù)。通過形態(tài)學(xué)特征及顯微觀察對所分離的菌種進行鑒定。各培養(yǎng)基的目標(biāo)培養(yǎng)物及培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 培養(yǎng)基的用途及培養(yǎng)條件Table 1 Usage and culture conditions of mediums

3）微生物的形態(tài)觀察[14-15]。細菌觀察：革蘭氏染色法。霉菌觀察：在干凈的載玻片中部滴加乳酸石炭酸棉藍染色液，挑取霉菌單個菌落，挑散于染色液中，蓋上蓋玻片，于40×10倍顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.3 待測樣品的制備

采用FW100 型高速萬能粉碎機粉碎樣品，過0.45 mm篩后，準(zhǔn)確稱取0.15 g（每個樣品3次重復(fù)），置于50 mL離心管內(nèi)，加入25 mL 50%乙醇后擰緊離心管蓋，置于70 ℃水浴鍋內(nèi)恒溫加熱30 min（每10 min搖動一次），取出后冷卻至室溫，在4 ℃、1.2×104r/min條件下離心15 min，取上清液作為待測樣品。

1.2.4 主要化學(xué)品質(zhì)指標(biāo)測定

含水量的測定采用120 ℃快速法（GB/T 8304—2013）；茶多酚含量的測定采用酒石酸亞鐵法（GB/T 8313—2002）；游離氨基酸總量的測定采用茚三酮比色法（GB/T 8314—2013）；水浸出物含量的測定采用全量法（GB/T 8305—2013）；沒食子酸、兒茶素組分含量的測定采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）。其中，沒食子酸、兒茶素組分的HPLC 檢測分析條件如下：Agilent TCC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 采用3%乙腈＋0.5%乙酸＋96.5%超純水，流動相B 采用30%乙腈＋0.5%乙酸＋69.5%超純水；進樣量10 μL，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm。洗脫梯度：0～40 min內(nèi)B相以線性增長方式由20%增加至75%，40.01 min 時下降至20%的B 相后，以20%的B相保持5 min。

1.2.5 茶葉感官審評方法

為了防止茶樣變質(zhì)，儲存到各時間節(jié)點的茶樣先放置在－20 ℃冰箱中保存，等所有處理茶樣完成儲藏試驗后再統(tǒng)一進行審評。依據(jù)GB/T 23776—2018，對茶樣的外形、湯色、香氣、滋味、葉底5 項因子分別進行評定，按外形20%、湯色15%、香氣25%、滋味30%、葉底10%計算品質(zhì)總分。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

各處理均設(shè)3次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件中的最小顯著差異法、鄧肯法及獨立樣本t檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中微生物數(shù)量變化

如表2所示，不同種群微生物相比，細菌總數(shù)明顯多于霉菌，且被檢出的霉菌菌落數(shù)比較少，酵母菌沒有被檢測到。輻照滅菌后未拆封的C1處理組，在貯藏的各個階段均未有微生物被檢出?？傮w而言，染菌茶樣的微生物數(shù)量較少且未在貯藏過程中快速增長。一方面可能是因為茶樣自帶的初始微生物種類和數(shù)量較少，另一方面可能是因為茶餅基質(zhì)含水量過低。如圖1 所示，茶餅含水量在整個貯藏期間波動范圍在7.0%～9.0%之間，且總體趨勢隨著貯藏時間的延長而降低，不能為微生物生長提供必要的水分。

2.2 主要品質(zhì)化學(xué)成分含量變化

由圖2 可知，貯藏過程中茶樣的水浸出物含量總體上呈波動上升趨勢，不同處理之間水浸出物變化幅度較為接近。

由圖3 可以看出，貯藏期間游離氨基酸總量總體呈下降趨勢，且不同處理之間氨基酸含量變化幅度較為接近。其中，9 kGy 輻照染菌處理茶樣存放在室溫和30 ℃條件下氨基酸減少較多，貯藏200 d時降幅分別為40.37%和38.82%。

表2 貯藏過程中微生物數(shù)量變化Table 2 Changes in the number of microorganisms during storage102CFU/g

圖1 貯藏過程中各處理茶樣含水量變化Fig.1 Changes in water content of tea samples in each treatment during storage

圖2 貯藏過程中各處理茶樣水浸出物含量變化Fig.2 Changes in aqueous extract content of tea samples in each treatment during storage

圖3 貯藏過程中各處理茶樣游離氨基酸總量變化Fig.3 Changes in free amino acid content of tea samples in each treatment during storage

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，茶多酚不可避免地發(fā)生了氧化，其含量呈波動下降趨勢，且各處理的變化趨勢較為一致。相對而言，經(jīng)9 kGy 較強輻照處理后再染菌茶樣的下降幅度更大一些，存放在室溫和30 ℃條件下200 d 后，茶多酚含量降幅分別為37.65%和36.73%。

由表3 可知，兒茶素總量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢；尤以酯型兒茶素含量下降趨勢更為明顯。

由圖5可知，經(jīng)200 d貯藏后，茶多酚、游離氧基酸等主要內(nèi)含成分含量均有所下降，只有水浸出物含量不降反升。

2.3 感官品質(zhì)評價

圖4 貯藏過程中各處理茶樣茶多酚含量變化Fig.4 Changes in tea polyphenol content of tea samples in each treatment during storage

表3 普洱生茶兒茶素含量變化Table 3 Changes in catechin content of raw Pu’er teamg/g

總體上，隨著貯藏時間的延長，各處理茶樣品質(zhì)得到明顯改善，香氣更加純正、濃厚，茶湯澀味減少，滋味更加濃醇（表4～6）。由表5可知，A2B2C1感官品質(zhì)最佳，得分相對較高，而A2B2C2茶樣品質(zhì)與未輻照的對照相比雖有改善，但總體品質(zhì)不如同等劑量輻照下的無菌處理。由表6 可知，在9 kGy 輻照處理下，無菌處理組A3B1C1的總體品質(zhì)優(yōu)于染菌處理組A3B1C2。比較表5和表6發(fā)現(xiàn)：輻照可以改善普洱生茶品質(zhì)，但并非輻照劑量越大越好，總體而言，5 kGy 無菌處理茶樣的品質(zhì)高于9 kGy 無菌處理，更高于未輻照處理，與周樹紅等對普洱熟茶貯藏試驗的研究結(jié)果[1]較為相似；對于貯藏環(huán)境，貯存在30 ℃恒溫條件下品質(zhì)改善效果總體上明顯優(yōu)于室溫貯藏。

圖5 貯藏200 d后各處理茶樣主要內(nèi)含成分變化幅度Fig.5 Variation range of main inclusion components of tea samples in each treatment stored for 200 d

表4 未輻照普洱生茶貯藏200 d后感官品質(zhì)評價結(jié)果Table 4 Sensory quality evaluation of unirradiated raw Pu’er tea stored for 200 d

表5 輻照5 kGy普洱生茶貯藏200 d后感官品質(zhì)評價結(jié)果Table 5 Sensory quality evaluation of irradiated 5 kGy raw Pu’er tea stored for 200 d

綜上所述，在本文貯藏條件下茶餅上附著的微生物對其品質(zhì)轉(zhuǎn)化不呈現(xiàn)正向促進作用，而輻照所帶來的化學(xué)氧化效應(yīng)對普洱生茶貯藏過程中的品質(zhì)轉(zhuǎn)化具有較明顯的效果。

3 討論

在本文試驗條件，未輻照滅菌和輻照后染菌處理的茶樣含有的微生物種類及數(shù)量較少，主要為霉菌和細菌（細菌含量相對較高），沒有檢測到酵母菌；且微生物數(shù)量變化沒有明顯規(guī)律。感官審評結(jié)果表明：在不同環(huán)境條件下貯藏的染菌處理的普洱生茶，在貯藏前期有苦澀味，而無菌處理的滋味相對濃醇甘爽；貯藏后期染菌處理的茶樣品質(zhì)有所改善，且優(yōu)于未經(jīng)輻照處理的，但其陳化品質(zhì)仍不如同等條件下的無菌處理，說明在本試驗條件下（溫濕度不高、茶餅含水率在10%以內(nèi)，類似干倉貯藏環(huán)境），少量微生物的存在對普洱生茶品質(zhì)沒有直接促進作用，而輻照所引起的化學(xué)氧化對陳化品質(zhì)的形成具有較明顯的作用，由此得出“化學(xué)氧化為普洱生茶陳化品質(zhì)形成的主要因素，而微生物和茶葉中殘余酶活性主導(dǎo)的氧化為次要因素”這一結(jié)論，但是對于微生物對普洱生茶的陳化是否有效以及相關(guān)的機制，仍需更多試驗數(shù)據(jù)加以分析和驗證。

表6 輻照9 kGy普洱生茶貯藏200 d后感官品質(zhì)評價結(jié)果Table 6 Sensory quality evaluation of irradiated 9 kGy raw Pu’er tea stored for 200 d

在貯藏過程中茶樣內(nèi)含物質(zhì)變化較為復(fù)雜，總體而言，水浸出物含量有一定幅度上升，而氨基酸、茶多酚和兒茶素含量均有一定幅度的下降，這與普洱生茶隨著貯藏時間延長其滋味變得較為醇厚、苦澀味逐漸減輕的基本變化趨勢較為吻合。

綜合本文的研究結(jié)果進一步推測，微生物對普洱生茶與熟茶的品質(zhì)轉(zhuǎn)化具有不一樣的作用。對熟茶而言，渥堆過程會滋生大量微生物，堆溫是渥堆過程中的主要控制因子，最低溫度不能低于40 ℃，最高溫度不能高于65 ℃，生產(chǎn)中的堆溫高低主要通過翻堆來調(diào)控[16]。根據(jù)長期的生產(chǎn)實踐和相關(guān)的檢測結(jié)果，一般認為，渥堆過程不會導(dǎo)致茶葉產(chǎn)生毒素，毒理學(xué)研究結(jié)果對普洱熟茶的安全性持肯定態(tài)度，人體的急性毒性試驗表明，在10 g/d時未發(fā)現(xiàn)血液和生理學(xué)變化，長期毒性試驗也未發(fā)現(xiàn)變化[17-20]。推測因渥堆過程中相對較高的溫度和茶葉中的茶多酚對微生物生長具有抑制作用，故渥堆時茶葉中一般不會出現(xiàn)有害菌的生長繁殖。但對生茶而言，因為一般采用常溫貯藏方式，缺乏高溫條件的制約，一旦茶餅含水率過高，可能為各種雜菌的生長繁殖創(chuàng)造條件，不僅容易產(chǎn)生濕倉味，造成風(fēng)味劣變[21]，而且其飲用安全性也會受到影響。所以，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定普洱生茶的含水量應(yīng)在13%以內(nèi)，以避免茶餅中微生物的生長繁殖。

致謝本文的微生物試驗得到了浙江大學(xué)食用菌研究所陳再鳴副教授的大力幫助，謹致謝意！