萬發(fā)香，王連臻，高軍

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

乙烯是一種重要的植物激素，在植物花的發(fā)育[1-2]、果實的成熟[3-5]、遭受機械損傷[6-7]和生物與非生物脅迫[8-10]等過程中具有重要的調(diào)控作用。而1-氨基環(huán)丙烷-1- 羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）合成酶（ACC synthase,ACS）是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)乙烯形成的關(guān)鍵酶和限速酶。ACC 合成酶（ACS）是以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate,PLP）為輔酶的酶家族，在高等植物中由多基因家族編碼[11]。已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了編碼ACC 合成酶的ACS基因，其中：擬南芥中存在12 個ACS基因[12]，番茄中至少存在9 個[7]，水稻中存在5個[11,13]，西葫蘆中至少有2個[11]，枇杷中至少有2個[14]等；并且在牽?；╗2]、獼猴桃[15]、香蕉[16]、西瓜[17]、葡萄[18]、桃[3]、番木瓜[19]、荔枝[20]、李[21]、甘蔗[22-24]、茶樹[25]和樹莓[26]等作物中也有ACS基因的相關(guān)研究報道。

茄子是生長在熱帶和溫帶地區(qū)的一種重要的蔬菜作物，而目前關(guān)于茄子中與乙烯生物合成相關(guān)的ACS基因的研究報道相對較少。因此，基于本課題組前期得到的茄子低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到1 個顯著差異表達基因，并根據(jù)該基因編碼的氨基酸序列，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blastp比對，發(fā)現(xiàn)其屬于編碼ACC合成酶的基因ACS。在此基礎(chǔ)上，對其進行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，同時，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）探究其在低溫、高溫、干旱和鹽脅迫處理不同時間后的表達情況，從而為進一步探索與逆境脅迫相關(guān)的茄子ACS基因（SmACS）的生物學(xué)功能研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

使用MEGA X 軟件，通過最大似然法（maximum likelihood,ML）構(gòu)建基于茄子SmACS與擬南芥、番茄和煙草等10個物種同源蛋白的系統(tǒng)進化樹；利用Jalview 軟件對10 個物種同源蛋白多重序列進行比對分析；使用在線工具MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）分析SmACS 蛋白的保守基序；使用TBtools 軟件分析SmACS基因的結(jié)構(gòu)[27]；利用在線工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析SmACS基因轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游2 000 bp啟動子區(qū)的順式作用元件；利用在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析茄子SmACS 蛋白的理化性質(zhì)；利用在線工具SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測茄子SmACS蛋白的信號肽；利用在線工具TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測茄子SmACS 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；使用在線工具CELLO 2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）對茄子SmACS蛋白進行定位預(yù)測；利用在線網(wǎng)站HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）分析SmACS的功能結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件NetPhos 3.1 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測SmACS 蛋白的磷酸化位點；使用在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測SmACS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；使用在線分析工具Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測SmACS 蛋白的三級結(jié)構(gòu)；利用在線分析軟件STRING（https://string-db.org/）預(yù)測SmACS 蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2 茄子SmACS 基因響應(yīng)逆境脅迫時的表達特性分析

以溫室（27 ℃條件下光照處理16 h/19 ℃條件下黑暗處理8 h）中盆栽生長60 d左右且大小一致的三月茄為實驗材料，分別對其進行低溫（4 ℃）、高溫（40 ℃）、干旱和鹽（200 mmol/L NaCl）脅迫處理，以未進行任何脅迫處理的葉片組織為對照組。在低溫和高溫脅迫組分別處理1、3、6、12和24 h，干旱脅迫組處理3、6 和12 h，鹽脅迫組處理6 h 后，摘取各處理葉片，迅速用液氮冷凍，之后置于－80 ℃冰箱中保存，備用。參照植物RNA 提取試劑盒（HiPure HP Plant RNA Kit）說明書，提取經(jīng)低溫、高溫、干旱和鹽脅迫處理不同時間后的三月茄葉片RNA；利用莫納生物反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（MonScriptTMRTⅢAll-in-One Mix with dsDNase）反轉(zhuǎn)錄不同處理樣品的RNA，得到cDNA；將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋一定倍數(shù)，作為qRT-PCR的模板。以腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（adenine phosphoribosyl transferase,APRT）為內(nèi)參基因并設(shè)計其引物；以SmACS-F、SmACS-R引物來檢測SmACS基因在不同逆境脅迫下的表達水平。引物序列見表1，委托北京擎科生物科技有限公司合成。在羅氏Cobaz480 實時熒光定量PCR 儀上進行qRT-PCR試驗，每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，采用2－△△CT法進行相對表達量的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子SmACS蛋白的同源性比對與分析

基于本課題組前期得到的茄子高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到1 個低溫脅迫后顯著差異表達的基因SmACS。根據(jù)該基因編碼的蛋白質(zhì)序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast搜索功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白與1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（ACC）的同源性最高。同時，篩選出20個與該蛋白同源性較高物種的蛋白質(zhì)序列，運用MEGA X 軟件的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明，SmACS 蛋白與大豆的相似性最高，為69.98%；與同屬茄科的番茄ACS 的同源性為69.65%；與擬南芥、煙草和番茄等10 個物種的相似性均在52%以上（圖1），說明該基因在生物進化過程中相對保守。進一步對SmACS蛋白進行多重比對發(fā)現(xiàn)，11個物種的ACS同工酶均含有7個保守結(jié)構(gòu)域，并含有轉(zhuǎn)氨酶中保守的氨基酸，且含有與底物特異性有關(guān)的保守谷氨酸殘基（圖2）。這說明茄子SmACS 蛋白具有高度保守的結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)氨酶位點。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.2 茄子SmACS 蛋白的保守基序（motif）及其基因結(jié)構(gòu)分析

圖1 茄子SmACS蛋白的氨基酸序列與其他物種同源序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of SmACS protein from eggplant and homologous sequences from other species

圖2 茄子SmACS蛋白與其他物種ACS蛋白序列多重比對結(jié)果Fig.2 Results of multiple alignment among SmACS protein from eggplant and ACS proteins from other species

為更好地了解SmACS基因的功能，對茄子SmACS 蛋白的保守基序、結(jié)構(gòu)域及其基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄子SmACS 蛋白含有10種保守基序（基序1～基序10），每種保守基序各有2個，且SmACS蛋白的最左側(cè)為基序2，最右側(cè)為基序8（圖3）。同時，分析SmACS基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該基因位于第8 號染色體上，基因全長3 550 bp，編碼序列長1 437 bp，含有3個內(nèi)含子和4個外顯子，屬典型的ACS基因結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖3 茄子SmACS蛋白的保守基序分析Fig.3 Conserved motif analysis of SmACS protein from eggplant

圖4 茄子SmACS基因結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Structure analysis of SmACS gene from eggplant

2.3 茄子SmACS 蛋白的理化性質(zhì)分析

利用在線工具ProtParam 分析茄子SmACS 蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明：SmACS蛋白主要由478個氨基酸組成，具體包括亮氨酸（leucine, Leu）43個，絲氨酸（serine, Ser）和纈氨酸（valine,Val）各33個，苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）32 個，天冬氨酸（aspartic acid,Asp）和賴氨酸（lysine, Lys）各31 個，丙氨酸（alanine,Ala）30 個，甘氨酸（glycine,Gly）和異亮氨酸（isoleucine, Ile）各29 個，天冬酰胺（asparagine,Asn）和谷氨酸（glutamic acid,Glu）各28個，精氨酸（arginine,Arg）25 個，蘇氨酸（threonine,Thr）22 個，脯氨酸（proline, Pro）19 個，谷氨酰胺（glutamine,Gln）和甲硫氨酸（methionine,Met）各14個，組氨酸（histidine,His）12 個，半胱氨酸（cysteine,Cys）10 個，酪氨酸（tyrosine, Tyr）9 個和色氨酸（tryptophane,Trp）6 個。其中，亮氨酸（Leu）的含量占比最大（9%），絲氨酸（Ser）和纈氨酸（Val）的含量占比次之（各占6.9%），色氨酸（Trp）的含量占比最?。▋H為1.3%）。茄子SmACS 蛋白的分子質(zhì)量為54.03 kDa，等電點為6.48，帶負電荷的Asp和Glu殘基總數(shù)為59，帶正電荷的Arg和Lys殘基總數(shù)為56；茄子SmACS 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.39，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為85.04，親水系數(shù)為－0.206，表明該蛋白為親水性蛋白。進一步分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白無信號肽，屬非分泌性蛋白，且不含跨膜結(jié)構(gòu)，表明其不屬于膜蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白主要定位于細胞質(zhì)中。

2.4 茄子SmACS 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要是指蛋白質(zhì)的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。通過在線SOPMA軟件預(yù)測茄子SmACS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，如圖5 所示：茄子SmACS蛋白二級結(jié)構(gòu)含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈；其中，213 個氨基酸構(gòu)成α-螺旋，所占比例最大（44.56%），158 個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占33.05%，70個氨基酸構(gòu)成延伸鏈，所占比例為14.64%，而37 個氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占7.74%。由此可見，茄子SmACS 蛋白的主要構(gòu)成元件為α-螺旋，其功能主要為連接其他二級結(jié)構(gòu)元件，而無規(guī)則卷曲為次要構(gòu)成元件。

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成使肽鏈中所有的原子都達到空間上的重新排布，它是建立在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域上的球狀蛋白質(zhì)的高級空間結(jié)構(gòu)。SmACS基因編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模的參考模板為1iay.1.A，提交的SmACS基因編碼的蛋白序列與模板覆蓋率為88%，序列一致性為73.87%，推測SmACS編碼的蛋白質(zhì)可能具備與參考模板相同的催化活性。通過Swiss-Model在線程序同源建模，預(yù)測SmACS蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，茄子SmACS蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖6），這與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致。

圖5 茄子SmACS蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果Fig.5 Predicted results of secondary structure of SmACS protein from eggplant

2.5 茄子SmACS蛋白的結(jié)構(gòu)域與磷酸化位點分析

利用在線網(wǎng)站HMMER 分析SmACS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖7）顯示：SmACS 具有保守的Aminotran_1_2 結(jié)構(gòu)域，與大豆ACS1基因編碼的蛋白質(zhì)的一致性為71.1%，相似性為86.7%，準確性為0.98。通過在線軟件NetPhos 3.1 Sever預(yù)測SmACS蛋白的磷酸化位點，結(jié)果（圖8）表明：SmACS 蛋白共存在39 個磷酸化位點，其中包括20 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點、16 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點和3 個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點。由此可見，茄子SmACS 蛋白的磷酸化位點主要以絲氨酸和蘇氨酸為主，酪氨酸最少。

圖6 茄子SmACS蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果Fig.6 Predicted result of tertiary structure of SmACS protein from eggplant

圖7 茄子SmACS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.7 Conserved domain of SmACS protein from eggplant

2.6 茄子SmACS 蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

由于茄子未被收集在STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫中，通過在線工具STRING將茄子SmACS蛋白與同屬茄科作物番茄的ACS1A蛋白進行比對，利用其蛋白互作關(guān)系構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)。如圖9所示：ACS1A蛋白與4 個ACC 氧化酶（100125909、ACO1、ACO2 和aco5）、1 個S-腺苷甲硫氨酸合酶（101245012）、2 個S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（101260400和101262142）、2 個抗壞血酸依賴性氧化還原酶（101266529 和543506）和1 個未被注釋到的蛋白（101265343）互作。推測茄子SmACS 蛋白主要與ACC 氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶和抗壞血酸依賴性氧化還原酶發(fā)生相互作用。

圖8 茄子SmACS蛋白的磷酸化位點Fig.8 Phosphorylation sites of SmACS protein from eggplant

2.7 茄子SmACS 基因的順式作用元件分析

利用在線工具PlantCARE 對SmACS基因起始密碼子上游2 000 bp 的序列進行順式作用元件分析。結(jié)果表明：SmACS基因包含TATA 框（TATAbox）和CACA 框（CACA-box）順式作用元件，表明SmACS基因能正常進行轉(zhuǎn)錄，且SmACS基因啟動子區(qū)含有脫落酸、乙烯、冷脅迫、水楊酸及傷口響應(yīng)等有關(guān)的元件，其中乙烯響應(yīng)元件最多，脫落酸和冷脅迫涉及的順式作用元件相對較多（表2）。表明茄子SmACS基因可能主要參與果實發(fā)育、低溫脅迫和脫落酸響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

圖9 ACS1A蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Interaction network of ACS1A protein

2.8 茄子SmACS基因響應(yīng)非生物脅迫的表達分析

為了進一步明確茄子SmACS基因的潛在功能，我們通過qRT-PCR 分析其在非生物脅迫處理后的表達情況。在4 ℃條件下處理不同時間時，SmACS基因受誘導(dǎo)表達，尤以4 ℃條件下處理12 h時，其表達量上調(diào)幅度最大，約為對照（0 h）的281.8 倍（圖10A）。在高溫（40 ℃）脅迫下，SmACS基因表達量呈先上升后降低的趨勢，其中，在1 和3 h 時表達量分別為對照（0 h）的7.5倍和4.6倍，而在6、12和24 h時，其表達受到抑制（圖10B）。在干旱脅迫下時，SmACS基因的表達量在3 h 時上調(diào)幅度最大，約為對照（0 h）的32.2倍；在6 h時，其表達量約為對照組的1.3倍；而處理12 h時，其表達受到抑制（圖10C）。受鹽（NaCl）脅迫6 h時，SmACS基因的表達上調(diào)，而該基因受NaCl 脅迫后在不同時間的表達情況還有待于進一步的試驗分析（圖10D）。由以上結(jié)果可知，SmACS基因可受低溫、高溫、干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)而表達，其中低溫（4 ℃）處理對SmACS基因表達的上調(diào)作用最為顯著。

表2 SmACS基因啟動子區(qū)域主要順式作用元件Table 2 Main Cis-acting elements in the promoter region of SmACS gene

3 討論

ACC 合成酶（ACS）是植物內(nèi)源乙烯合成途徑中的限速酶和關(guān)鍵酶，由多基因家族編碼。目前，在擬南芥、番茄、水稻和枇杷等作物中均有關(guān)于ACS基因的研究報道，而在茄子中至今未有相關(guān)的ACS基因的研究報道。本研究中，對推測的茄子SmACS基因編碼的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對，發(fā)現(xiàn)SmACS蛋白與其他物種的ACS蛋白同源性很高，其中與大豆的同源性最高（69.98%），與同屬茄科的番茄ACS 的同源性為69.65%，略低于大豆的，可能是由于ACC 合成酶是由多基因家族編碼，而SmACS 氨基酸序列與番茄的ACS 氨基酸序列差異較大，導(dǎo)致2 個物種的同源性較低，這與吳建陽等[20]對荔枝的研究結(jié)果類似。進一步的同源比對分析顯示，SmACS編碼的氨基酸序列比較保守，含有7個保守結(jié)構(gòu)域、11個轉(zhuǎn)氨酶中保守的氨基酸以及與底物特異性有關(guān)的保守谷氨酸殘基，這與荔枝ACS1基因的研究結(jié)果[20]一致。

茄子SmACS基因包含4 個外顯子和3 個內(nèi)含子，屬典型的ACS基因結(jié)構(gòu)，這與牡丹中ACS基因結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果[28]一致。對SmACS 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，茄子SmACS蛋白由478個氨基酸組成，等電點為6.48，分子質(zhì)量為54.03 kDa，為定位于細胞質(zhì)中的不穩(wěn)定的非分泌型親水蛋白，這與牡丹ACS基因的研究結(jié)果[28]基本一致。

圖10 茄子SmACS基因響應(yīng)逆境脅迫的表達分析Fig.10 Expression analysis of SmACS gene from eggplant in response to adversity stresses

對啟動子元件的分析發(fā)現(xiàn)，茄子SmACS基因主要含有乙烯、脫落酸和冷脅迫相關(guān)的順式作用元件。ACS基因可受脫落酸、乙烯、細胞分裂素和赤霉素等激素的誘導(dǎo)而表達，如乙烯能夠誘導(dǎo)甘蔗基因Sc2ACS1、Sc2ACS2、Sc2ACS3的上調(diào)表達，并且甘蔗基因Sc2ACS1還可受冷脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)表達[23]。推測茄子SmACS基因可能在果實發(fā)育、冷脅迫和脫落酸響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。qRT-PCR 結(jié)果證實，茄子SmACS基因可受不同逆境脅迫誘導(dǎo)而表達，其中低溫脅迫時誘導(dǎo)表達上調(diào)最顯著。而有關(guān)SmACS基因在果實發(fā)育和脫落酸處理時的表達情況還有待進一步研究分析。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，茄子ACC 合成酶基因SmACS位于第8 號染色體上，基因全長3 550 bp，編碼序列長1 437 bp，含有3 個內(nèi)含子和4 個外顯子，屬典型的ACS基因結(jié)構(gòu)。其編碼的蛋白質(zhì)由478個氨基酸組成，是一種定位于細胞質(zhì)的不穩(wěn)定的非分泌型親水蛋白，主要構(gòu)成元件為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，具有保守的Aminotran_1_2 結(jié)構(gòu)域，含有39 個磷酸化位點，其中以絲氨酸和蘇氨酸為主。茄子ACC合成酶與ACC 氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶和抗壞血酸依賴性氧化還原酶發(fā)生相互作用。該基因啟動子中含有與乙烯、脫落酸和非生物脅迫等有關(guān)的順式作用元件；qRT-PCR結(jié)果表明，SmACS基因可受非生物脅迫（低溫、高溫、干旱和鹽）誘導(dǎo)而表達，其中低溫處理時誘導(dǎo)表達上調(diào)最顯著，但有關(guān)SmACS基因在乙烯和脫落酸處理時的表達情況還有待進一步研究分析。