程鐵轅，尹希杰，夏于林，蘇 靜

（1.成都海關(guān)技術(shù)中心宜賓分部 國家酒類檢測重點實驗室，四川宜賓 644000；2.自然資源部第三海洋研究所信息與測試保障中心，福建廈門 361000）

0 引言

當前，國內(nèi)白酒市場上普遍以固態(tài)法白酒酒質(zhì)最佳，其以純糧釀造及非添加等為主要賣點，消費者認可度最高，同時，因其較高的商品利潤以及摻假白酒鑒別難度極大，令固態(tài)法白酒成為摻假重災區(qū)。白酒摻假方式多種多樣，主要通過添加食用酒精、香精、香料等物質(zhì)實現(xiàn)，摻假白酒成品除理化指標等達到國標要求外，產(chǎn)品在口感上，也會盡可能地貼近固態(tài)法白酒真實口感。目前，國內(nèi)市場上流行范圍最廣的白酒類別是濃香型白酒，相對而言，固態(tài)法濃香型白酒摻假工藝較為簡單，主要添加物質(zhì)有乙醇（主要為食用酒精）和己酸乙酯兩種，其中，己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味成分，添加的己酸乙酯主要為化學合成物質(zhì)或者液態(tài)法發(fā)酵產(chǎn)物等。盡管摻假的己酸乙酯能夠達到食品級，但無論是從濃香型白酒國標GB/T 10781.1—2006《濃香型白酒》規(guī)定來看，還是從白酒市場交易公平公正的角度而言，此類摻假行為均是嚴格禁止的?，F(xiàn)階段涉及白酒摻假的鑒別研究更多地集中于食用酒精摻假方面，很多研究人員應用了多種分析檢測技術(shù)，主要有穩(wěn)定同位素技術(shù)［1-6］、液相色譜 - 質(zhì)譜技術(shù)［7］、電子鼻技術(shù)等分析檢測技術(shù)［8］，上述技術(shù)在食品分析檢測中也應用廣泛［9-10］，其中穩(wěn)定同位素技術(shù)在食用酒精鑒別方面的應用效果較好，取得了一定的研究進展［11-14］，但關(guān)于碳穩(wěn)定同位素技術(shù)應用于固態(tài)法濃香型白酒中己酸乙酯摻假的鑒別研究，目前尚無相關(guān)報道。本研究擬采用GC-C-IRMS技術(shù)，對5種不同等級、不同年份的固態(tài)法濃香型原酒和3種己酸乙酯摻假白酒中己酸乙酯碳同位素組成進行分析研究，以期為市場監(jiān)管機構(gòu)及檢測機構(gòu)提供一種己酸乙酯摻假白酒的鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

購自川南某白酒廠不同等級不同年份的五糧固態(tài)法濃香型原酒樣品共5個品種，編號為1#～5#，其中，1#樣品為2009年產(chǎn)一級原酒，2#樣品為2018年產(chǎn)一級原酒，3#樣品為2018年產(chǎn)優(yōu)級原酒，4#樣品為2019年產(chǎn)一級原酒，5#樣品為2019年產(chǎn)優(yōu)級原酒；6#樣品為自制添加高酯酒摻假樣品（高酯酒購自國內(nèi)某企業(yè)）；7#樣品為自制添加合成己酸乙酯摻假樣品（己酸乙酯為某網(wǎng)站購買）；8#樣品為自制添加生物發(fā)酵法己酸乙酯摻假樣品（己酸乙酯為某網(wǎng)站購買）。6#、7#和8#這3種摻假白酒是對市面上廣泛存在的幾種己酸乙酯摻假白酒的高度模擬。

1.2 試驗條件

1.2.1 儀器設備與試劑

儀器設備：氣相色譜-高溫氧化-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（GC-C-IRMS，美國Thermo Fisher公司），主要有氣相色譜儀（Trace GC Ultra）、燃燒爐（Combustion Ⅲ）、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（MAT253）。

試劑及耗材：高純He（99.999%）；選用己酸乙酯和乙酸戊酯兩種化合物作為碳同位素標樣，用EA-IRMS分別標定其碳同位素組成，己酸乙酯 δ13C 值為 -27.62‰±0.1‰，乙酸戊酯 δ13C 值為-29.06‰±0.1‰。

1.2.2 氣相色譜及質(zhì)譜條件

采用HP-INNOWax毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent J&W）；載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為3 mL/min，樣品采用不分流進樣，進樣量為0.3～2 μL，柱溫箱起始溫度40 ℃，保持4 min，先以 5 ℃/min 升至 92 ℃，再以 30 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。進樣口溫度230 ℃，氧化爐（NiO/CuO/Pt）溫度為960 ℃，還原爐溫度為640 ℃。離子源高壓10.0 kV，發(fā)射電流1.5 mA。每檢測兩個樣品后，進一次標準樣品。

1.3 測試流程及結(jié)果表示

利用氣相色譜-高溫氧化-同位素比值質(zhì)譜儀進行白酒中己酸乙酯單體碳同位素測試。GCC-IRMS由Thermo Trace GC Ultra型氣相色譜儀和GC Combustion Ⅲ裝置在線連接的MAT253同位素比值質(zhì)譜儀組成，單體化合物經(jīng)氣相色譜分離后依次進入氧化爐裝置，并在960°下完全氧化為CO2，然后CO2被載氣帶入同位素比值質(zhì)譜儀進行碳同位素組成測試。

穩(wěn)定同位素自然豐度一般用 δ 值表示，以千分差（‰，permill）為單位，即被分析樣品與試驗室參比物質(zhì)相對測量得到的同位素比值的千分差，再將此值換算成相對于國際標準的 δ 值。碳同位素值用相對國際標準物VPDB作為參考標準，其值按以下公式計算：

式中 R（13C/12CVPDB）——國際標準物VPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）的碳同位素豐度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗結(jié)果

2.1.1 己酸乙酯和乙酸戊酯標樣測試結(jié)果

圖1為試驗室60%乙醇水溶液配制己酸乙酯和乙酸戊酯的標樣譜圖，譜圖中橫坐標為時間（s），上圖縱坐標為m/z 46/44和45/44信號比值；下圖縱坐標為質(zhì)量數(shù)和所帶電荷數(shù)之比（m/z）44、45、46的離子流強度（mV）。

圖1 標準樣品譜圖Fig.1 Standard sample spectrum

根據(jù)1.2.2色譜及質(zhì)譜條件，標樣中乙酸戊酯化合物的出峰相對保留時間為620.3 s，m/z 44的信號強度為5 787 mV，己酸乙酯出峰相對保留時間為729.6 s，m/z 44的信號強度為7 759 mV試驗使用的同位素質(zhì)譜儀器的m/z 44基線的信號強度約為70 mV，選擇樣品產(chǎn)生m/z 44信號強度為420 mV（6倍基線信號）時，目標化合物碳元素物質(zhì)量為該方法的測試下限，當m/z 44信號強度約為420 mV時，所需己酸乙酯絕對量為0.097 5 μg，即每μL樣品溶液中己酸乙酯的最低檢出限為0.097 5 μg/μL，若需樣品m/z 44信號強度在3 000～8 000 mV范圍內(nèi)，需要每μL樣品溶液中己酸乙酯的濃度為0.696～1.857 μg/μL。

試驗室配制60%乙醇水溶液的己酸乙酯和乙酸戊酯標樣的 δ13C值見表1。

表1 標樣中己酸乙酯和乙酸戊酯 δ13C值及其標準偏差Tab.1 The δ13C values and standard deviations of ethyl caproate and amyl acetate in standard samples

從表可以看出，將己酸乙酯標樣重復三測定，δ13C值范圍在-27.15‰～-27.36‰之間，平均值為-27.28‰，標準偏差的STD值為0.11，與真值的差值為0.34‰；將乙酸戊酯標樣重復三測定，δ13C值范圍在-28.99‰～-29.15‰之間，平均值為-29.05‰，標準偏差的STD值為0.09，與真值的差值為0.01‰。兩種標樣 δ13C值的測試標準偏差均小于國際穩(wěn)定同位素測試允許值0.2‰，表明該方法測試平行性良好，測試精度滿足要求。

2.1.2 樣品測試結(jié)果

選擇5種固態(tài)法濃香型原酒中1#樣品和3種摻假白酒中7#樣品的譜圖進行描述，1#樣品譜圖如圖2所示，7#樣品譜圖如圖3所示。譜圖中橫坐標為時間（s），上圖縱坐標為m/z 46/44和45/44信號比值；下圖縱坐標為質(zhì)量數(shù)和所帶電荷數(shù)之比（m/z）44、45、46的離子流強度（mV）。由于固態(tài)法濃香型原酒樣品中成分復雜，檢測器只采集500～850 s之間的譜圖數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)m/z 44信號強度超過420 mV的峰共6個，根據(jù)與標樣中己酸乙酯的保留時間對比，確定樣品中4號峰為目標化合物己酸乙酯峰，出峰時間為715.6 s，m/z 44的信號強度為5 512 mV。7#樣品譜圖數(shù)據(jù)的采集時間與1#樣品相同，m/z 44信號強度超過420 mV的峰共2個，根據(jù)與標樣中己酸乙酯的保留時間對比，確定樣品中1號峰為目標化合物己酸乙酯峰，出峰時間為718.3 s，m/z 44的信號強度為8 151 mV。

圖2 1#樣品譜圖Fig.2 1# sample spectrum

圖3 7#樣品譜圖Fig.3 7# sample spectrum

1#～8#樣品測試結(jié)果見表2，每個樣品平行測試兩次，結(jié)果顯示己酸乙酯 δ13C值兩次測試差值范圍在0.01‰～0.32‰之間，能夠滿足高溫氧化法測試單體化合物碳同位素的技術(shù)精度要求。取兩次測試的平均值為測試結(jié)果，八個樣品的己酸乙酯 δ13C值范圍為-15.19‰～-33.97‰。可以發(fā)現(xiàn)1#～5#固態(tài)法濃香型原酒樣品與6#～8#摻假白酒樣品中己酸乙酯 δ13C值之間存在明顯差異，從整體數(shù)據(jù)比較來看，前者明顯高于后者。

表2 樣品中己酸乙酯 δ13C值Tab.2 The δ13C value of ethyl caproate in the sample

2.2 分析與討論

在8個樣品中，按照樣品類型可分為兩組，其中，1#～5#各固態(tài)法濃香型原酒為一組，1#～5#樣品包含了兩種不同等級（優(yōu)級、一級）、3個不同年份（2009年、2018年和2019年）的固態(tài)法濃香型原酒；6#～8#各自制摻假白酒為一組，6#～8#樣品包含了市面上廣泛存在的最主要的幾種己酸乙酯摻假的白酒。從測試結(jié)果來看，不同等級和年份的固態(tài)法濃香型原酒中己酸乙酯碳同位素值存在差異，其己酸乙酯 δ13C值范圍為-15.19‰～-22.14‰。就本次樣品測試結(jié)果而言，與2018年、2019年原酒相比，2009年原酒中己酸乙酯碳同位素值相對偏輕，此外，就各年份的優(yōu)級原酒和一級原酒而言，2019年的優(yōu)級原酒與一級原酒中己酸乙酯碳同位素值基本無差異，而2018年優(yōu)級原酒與一級原酒中己酸乙酯碳同位素值差異較大，其一級原酒中己酸乙酯碳同位素值相對偏重。優(yōu)級原酒（2018年）、一級原酒（2018年）和一級原酒（2009年）中己酸乙酯碳同位素組成的差異，可能是由釀酒原料（五種糧食及其配比）的碳同位素組成的差異、發(fā)酵工藝或保存過程中碳同位素分餾所導致，具體由哪種因素所導致，可能需要進一步研究。

3種摻假白酒中（添加高酯酒摻假，添加化學合成己酸乙酯摻假，添加生物發(fā)酵法己酸乙酯摻假）己酸乙酯 δ13C值范圍為-28.34‰～-33.97‰，可以看出，摻假白酒中3種不同生成途徑的己酸乙酯 δ13C值也存在明顯差異，其中，生物發(fā)酵法生成的己酸乙酯 δ13C值-33.97‰，明顯低于化學合成的己酸乙酯 δ13C值-28.34‰，也進一步驗證了生物發(fā)酵法生成的己酸乙酯會產(chǎn)生較大的碳同位素分餾，導致生物發(fā)酵產(chǎn)生的己酸乙酯具有相對較低的 δ13C 值［15-17］。

對兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本檢驗后發(fā)現(xiàn)（見表3）：t檢驗結(jié)果顯示 sig.（雙側(cè)）=0.001＜0.05，表明兩組數(shù)據(jù)均值之間存在顯著性差異，即固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒在己酸乙酯 δ13C值上存在顯著性差異，同時，也表明了添加一定數(shù)量的己酸乙酯（非固態(tài)發(fā)酵法來源）就會使原白酒中己酸乙酯碳同位素值發(fā)生變化，試驗結(jié)果表明：利用GC-C-IRMS技術(shù)，對白酒中己酸乙酯 δ13C值進行測試，就可能將固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒（己酸乙酯摻假）進行有效區(qū)分。

表3 獨立樣本檢驗Tab.3 Independent sample T-test

3 結(jié)語

本文采用GC-C-IRMS技術(shù)，分別對固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒中己酸乙酯碳同位素組成進行分析測試，發(fā)現(xiàn)固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒在己酸乙酯 δ13C值上存在顯著性差異，原酒中己酸乙酯碳同位素組成相對摻假白酒明顯偏重，t檢驗結(jié)果顯示 sig.（雙側(cè)）=0.001＜0.05，表明該方法應用于白酒中己酸乙酯的摻假鑒別具有一定的可行性，可以為市場監(jiān)管機構(gòu)及檢測機構(gòu)提供一種具有一定應用價值的分析方法。