俞儀萱 楊濤 張靜怡 魯星妤 董慧靜 胡紫馨 崔慧娟

食管癌是一種以進行性吞咽困難為主要表現(xiàn)的消化道惡性腫瘤。我國食管癌的死亡率位居惡性腫瘤的第六位[1]，5年生存率僅20%[2]。近年來，食管癌免疫治療技術不斷進展[3]?；贙EYNOTE-590的研究結(jié)果[4]，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（national comprehensive cancer network，NCCN）惡性腫瘤臨床實踐指南推薦將帕博利珠單抗（pembrolizumab）作為程序性死亡蛋白配體 1（programmed death protein-ligand 1，PD-L1）高表達或錯配修復缺陷、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定食管癌患者的二線標準治療方案。然而，僅有小部分食管癌患者能從免疫治療中取得良好效果，篩選潛在獲益人群的相關生物標志物仍亟待探索。腫瘤免疫浸潤特點是指腫瘤微環(huán)境中各類浸潤性免疫細胞聚集分布的特征。研究證實，免疫浸潤特點是影響食管癌免疫治療臨床獲益的關鍵因素[5-6]，同時，浸潤性免疫細胞可用于評估預后[7]或作為候選的治療靶點[8]。本研究采集癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中食管癌組織的基因轉(zhuǎn)錄本與患者的臨床特征，采用CIBERSORT算法[9]，對食管癌組織中22種浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比進行測算，分析它們與預后的相關性，并構(gòu)建生存預后模型，揭示食管癌的免疫微環(huán)境，為免疫治療相關生物標志物的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 食管癌患者食管癌組織的基因轉(zhuǎn)錄本及臨床特征均從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）獲取，包含160例食管癌組織樣本和11例正常食管組織樣本?；颊叩呐R床特征包括性別、生存狀態(tài)、生存時間、腫瘤分期、TNM分期等，共183例。并在R軟件中使用limma包對轉(zhuǎn)錄本特征進行校正。同時，從基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載包含食管癌組織和正常食管組織樣本的基因表達譜芯片數(shù)據(jù)集GSE26886用于驗證。

1.2 研究方法 采用CIBERSORT算法計算食管癌組織及正常食管組織基因轉(zhuǎn)錄本中浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比，使用標準基因表達數(shù)據(jù)評估樣本中22種浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比。使用R軟件中的survival包、survivalROC包對浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比與臨床特征進行相關性分析，建立Cox比例風險回歸模型。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0和R 4.0.3統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗或秩和檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風險回歸模型分析浸潤性免疫細胞與臨床生存情況的關系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織的免疫浸潤特點 經(jīng)CIBERSORT算法測算后，篩選P＜0.05的樣本，得到食管癌組織樣本94例，正常食管組織樣本5例。計算樣本中22種浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中占比最高的3種浸潤性免疫細胞分別為未活化的CD4+記憶性T細胞（20.28%）、M0巨噬細胞（16.64%）和M2巨噬細胞（11.50%）。

相關性熱圖反映了食管癌組織中浸潤性免疫細胞之間的關聯(lián)，見圖1（插頁），結(jié)果顯示，活化的CD4+記憶性T細胞與CD8+T細胞呈正相關（r=0.49，P＜0.05），濾泡輔助性T細胞（T cells follicular helper，Tfh）與未活化的 CD4+記憶性 T 細胞呈負相關（r=-0.47，P＜0.05）。

圖1 食管癌組織免疫細胞相關性熱圖

2.2 食管癌組織與正常食管組織免疫浸潤特點比較比較食管癌組織與正常食管組織中浸潤性免疫細胞構(gòu)成比的差異，并使用GSE26886的數(shù)據(jù)集進行驗證。結(jié)果表明，樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）（P＜0.05）、未活化的肥大細胞（P＜0.05）和M0巨噬細胞（P＜0.05）的構(gòu)成比在兩組樣本間存在差異。其中，未活化的肥大細胞在食管癌組織中的構(gòu)成比低于正常食管組織，M0巨噬細胞在食管癌組織中的構(gòu)成比高于正常食管組織。

2.3 食管癌組織樣本臨床基本特征 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載183例食管癌組織樣本的臨床基本特征，對其進行統(tǒng)計，見表1。其中臨床特征未知者，統(tǒng)計該項時予以剔除。

表1 食管癌組織樣本臨床基本特征

2.4 食管癌組織浸潤性免疫細胞構(gòu)成比與臨床特征的關系 分析食管癌組織浸潤性免疫細胞構(gòu)成比與臨床基本特征（包括性別、腫瘤分期、TNM分期等）的關系。結(jié)果顯示，男性食管癌患者具有更高構(gòu)成比的未活化的肥大細胞（P＜0.05），高構(gòu)成比的活化的DCs與食管癌較低的T分期有關（P＜0.05），見圖2。

圖2 兩種浸潤性免疫細胞構(gòu)成比與臨床特征的關系

2.5 浸潤性免疫細胞構(gòu)成比與生存預后的關系 以每種浸潤性免疫細胞在所有食管癌組織樣本中的中位值為界，將樣本劃分為低構(gòu)成比組（Low）與高構(gòu)成比組（High），通過Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，高構(gòu)成比未活化的DCs可能預示著較短的生存時間（P＜0.05），見圖3。

圖3 未活化的樹突狀細胞（DCs）低構(gòu)成比組與高構(gòu)成比組患者生存曲線比較

2.6 食管癌浸潤性免疫細胞相關生存預后模型的建立將樣本中浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比納入Cox比例風險回歸模型，結(jié)果表明，高表達的Tfh（P＜0.05）與未活化的DCs（P＜0.05）細胞提示較差的生存預后，見圖4a。結(jié)合Kaplan-Meier法分析結(jié)果及相關研究[10]，將兩者納入生存預后模型的構(gòu)建，得到食管癌患者5年生存期預后的公式：5年生存率=0.4047×Tfh的比例+0.3181×未活化的DCs的比例。

在此基礎上，根據(jù)風險評分的中位數(shù)，將患者分為低免疫風險評分組和高免疫風險評分組。生存曲線提示，低免疫風險評分組相比高免疫風險評分組的預后更好，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ROC曲線反映該模型可以較好預測患者的5年生存率（AUC=0.732），見圖4b。

圖4 食管癌免疫浸潤Cox風險比例回歸模型的評價（a：高、低免疫風險評分組的生存曲線；b：生存預后模型評價的ROC曲線）

3 討論

食管癌免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后關系密切[11]，同時，免疫浸潤特點會影響患者對免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的反應[12]。以往通過免疫組化、流式細胞學等方式測定腫瘤組織中浸潤性免疫細胞的構(gòu)成比具有一定的難度，很難展現(xiàn)食管癌組織的免疫全景。同時，傳統(tǒng)的免疫標志物如腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）、PD-L1 等[13]尚不能精準地預測免疫治療的療效。研究者們致力于探索更簡便的方式篩選食管癌免疫療法獲益的潛在人群。

本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織的浸潤性免疫細胞中，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM）[14]的構(gòu)成比較正常食管組織高，未活化的肥大細胞的構(gòu)成比較正常食管組織低，筆者認為它們可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關；而Tfh和DCs則與食管癌患者生存預后有關。

TAM包括未活化的M0巨噬細胞、促炎癥的M1巨噬細胞及免疫抑制性M2巨噬細胞[15]，它們與炎癥反應及腫瘤抑制有關，在腫瘤組織附近聚集，塑造著腫瘤免疫微環(huán)境。以往的研究與本研究均證實了食管癌組織中TAM構(gòu)成比較正常食管組織更高[16]，但并非所有亞型都表達出了明顯的差異，比如M2巨噬細胞。TAM亞型的表達構(gòu)成比可能與食管癌患者預后有關[17]，但本研究的結(jié)果并沒有充分表達這一特點。目前，針對TAM的療法[18]及評估PD-1/PD-L1表達和TAM構(gòu)成比聯(lián)系的研究[19]正在進行，而TAM亞型或可成為治療的新靶標。

未活化的肥大細胞在正常食管組織、食管癌組織中構(gòu)成比不同，不同性別中也存在差異。既往的研究無法明確高構(gòu)成比的肥大細胞對于機體免疫能力的調(diào)節(jié)作用[20-21]，Derakhshani等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞所發(fā)揮的作用取決于腫瘤類型等多種因素。本研究對肥大細胞的分析較為局限，然而，隨著性別對于免疫療法尤其是免疫檢查點抑制劑的影響逐漸受到關注與肯定[23-24]，未來或可加深對浸潤性免疫細胞亞型與性別聯(lián)系的研究。

本研究以Tfh、未活化的DCs為指標構(gòu)建出了食管癌生存預后的模型，結(jié)果表明高構(gòu)成比的未活化DCs和Tfh提示著較差的生存預后。DCs與食管癌的免疫浸潤特點關系密切，研究中它顯示出了與T分期、生存預后等的聯(lián)系。高表達的活化的DCs與食管癌較低的T分期相關，與既往的研究結(jié)果相符[25-26]。但同時說明，DCs可能只影響原位癌的分期，與淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移關系不強。然而，研究中高構(gòu)成比的未活化的DCs又與較差的生存預后相關，似乎與“較低的T分期”這一結(jié)果相左。這種可能是DCs的活化狀態(tài)不同所導致的：食管癌微環(huán)境中含有大量腫瘤抗原，更多的成熟DCs提供了更強的抗原提呈力，則T分期低。未活化的DCs抗原提呈力弱，伴隨著較低的免疫效能，故預后差。這提示不同活化狀態(tài)的DCs可能是獨立在食管癌發(fā)生、發(fā)展、臨床預后中發(fā)揮作用的。但是，Nishimura等[27]應用免疫組化法測定食管鱗癌組織的DCs，認為更精確的生存模型需建立在對DCs表型LAMP-3的測定之上，只有表達出LAMP-3的成熟DCs，才直接主導了食管癌患者的免疫反應。這或可為近年來基于DCs的疫苗開發(fā)提供支持[28]。

Tfh的構(gòu)成比在本研究中也顯示出與較差的預后相關。Tfh可以幫助B細胞建立生發(fā)中心，間接調(diào)節(jié)體液免疫，在食管癌及其他實體瘤的腫瘤微環(huán)境中起到調(diào)控作用[29]。已有的研究指出，Tfh的構(gòu)成比與乳腺癌[30]、肺癌[31]等的生存預后有關。Tfh細胞上高表達PD-1，高構(gòu)成比的Tfh可能是由于PD-1/PD-L1信號通路被阻斷而產(chǎn)生的[32]，這不僅使腫瘤免疫整體趨向體液免疫，同時也不利于機體發(fā)揮免疫作用。

綜上所述，本研究呈現(xiàn)了食管癌免疫浸潤的特點，揭示了22種浸潤性免疫細胞與食管癌臨床特征、預后的關系，為食管癌發(fā)生發(fā)展機制的探索、免疫治療效果預測的生物標志物和治療靶點的選擇提供了參考。但本研究仍存在一定的局限：（1）TCGA數(shù)據(jù)庫中包含的正常食管組織樣本較少，盡管本研究使用了GEO數(shù)據(jù)集進行了驗證，但未來仍需納入更多的外部數(shù)據(jù)提高結(jié)果的可靠性；（2）某些臨床數(shù)據(jù)缺乏年齡、分級、無進展生存期等特征，且各組間食管癌樣本數(shù)量分布不均，導致本研究無法全面評估免疫浸潤特點與臨床特征的關系；（3）缺乏亞洲來源的樣本，由于種族間的免疫差異，研究對于我國食管癌患者的適用性仍需進一步驗證。