林慧，劉英，文平，胡素熔，段金良

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院生殖中心，桂林 541002)

2016年7月，國際胚胎植入前遺傳學(xué)診斷協(xié)會(PGDIS)修改之前所提的胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)指南，第一次允許選擇性移植嵌合體胚胎[1-2]。同時，PGS也更名為胚胎植入前遺傳學(xué)非整倍體檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)。這些變化，至少在某種程度上，是對發(fā)表在2015年的兩個關(guān)于移植“不正常”胚胎后出生健康活產(chǎn)嬰兒報告的回應(yīng)[3-4]。近幾年來，國外有部分關(guān)于移植嵌合體胚胎、“不正?！迸咛サ膱蟮繹5-6]，然而關(guān)于囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞嵌合胚胎移植的結(jié)局尚存在爭議，有文獻(xiàn)報道囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞嵌合程度不是預(yù)測持續(xù)妊娠率和流產(chǎn)率的良好指標(biāo)[7]。目前，國內(nèi)幾乎無移植嵌合體胚胎的報道，本研究總結(jié)我中心近兩年來的相關(guān)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

一、資料與方法

1.研究對象：選取2018年4月至2020年11月于本院生殖中心行PGT-A的患者。這些患者經(jīng)取卵、授精后將胚胎培養(yǎng)至囊胚期進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，采用基于染色體拷貝數(shù)變異的二代測序方法檢測。有少部分患者無整倍體胚胎，患者知情同意后選擇移植嵌合體胚胎。移植前所有患者(n=14)均經(jīng)過遺傳咨詢且簽署高通量測序知情同意書以及胚胎解凍知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女方高齡(≥38歲)；反復(fù)自然流產(chǎn)(≥2次)；反復(fù)著床失?。蝗旧w異常(易位、倒位等)，滿足以上1條即可。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮解剖結(jié)構(gòu)異常；內(nèi)分泌疾??；自身免疫性疾?。蛔訉m內(nèi)膜異位癥。

2.囊胚檢測及凍融移植：(1)囊胚活檢：囊胚評分參考Gardner 評分系統(tǒng)[8]，本中心活檢的胚胎均為D5或D6囊胚(3～4期，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評分在B級以上)。當(dāng)囊胚達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)時，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)用激光儀在透明帶上打孔，將囊胚繼續(xù)培養(yǎng) 2～4 h?；顧z時，取外滋養(yǎng)層細(xì)胞5～10 個左右，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后放入事先裝有2.5 μl PBS緩沖液的PCR管內(nèi)，離心后于-20℃冰箱凍存待檢?；顧z后囊胚采用玻璃化冷凍法保存于液氮中。(2)PGT-A檢測：采用PicoPLEX方法將待測樣本進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，按操作步驟進(jìn)行，放入設(shè)定好參數(shù)的 PCR 儀中，先裂解細(xì)胞，隨后經(jīng)過預(yù)擴(kuò)增，最后經(jīng)過指數(shù)擴(kuò)增，用Qubit 3.0將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定量；片段選擇；構(gòu)建文庫并將構(gòu)建好的文庫純化后定量；模板制備與富集：測序文庫與乳液PCR緩沖液、乳液PCR酶混合液、模板載體溶液構(gòu)建“油包水” PCR 反應(yīng)單元；在DA8600 測序平臺完成測序工作；采用“遺傳學(xué)檢測分析管理系統(tǒng)”對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。(3)凍融胚胎移植：采用人工周期的方法準(zhǔn)備內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，移植日將經(jīng)PGT-A檢測后的可移植的嵌合體胚胎玻璃化解凍，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后移植。

3.妊娠判定及隨訪：移植后第14天檢測血β-HCG，移植后第28天陰道B超探及妊娠囊為臨床妊娠。生殖中心隨訪專職護(hù)士通過電話方式對患者進(jìn)行隨訪，包括HCG結(jié)果、B超情況、羊水穿刺結(jié)果及胎兒出生情況等。

4.觀察指標(biāo)：經(jīng)過高通量測序檢測，分析14例嵌合體胚胎的檢測結(jié)果及解凍移植后的臨床妊娠率及流產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：計數(shù)資料采用率(%)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)描述。

二、結(jié)果

1.嵌合體胚胎的高通量測序結(jié)果：14例嵌合體胚胎涉及1條或2條染色體的嵌合，嵌合的形式為單體、部分片段單體、部分片段三體嵌合，以部分片段單體嵌合為主(表1)。

表1 嵌合體胚胎的高通量測序結(jié)果

2.嵌合體胚胎移植后的妊娠結(jié)局：14例移植嵌合體胚胎的患者中，有6例臨床妊娠。其中2例已分娩，出生嬰兒身體健康，外觀無異常；有3例已行產(chǎn)前診斷，胎兒染色體正常；1例于孕8周胚胎停育。嵌合體胚胎移植的著床率和臨床妊娠率均為42.86%(6/14)，流產(chǎn)率為16.67%(1/6)(表2)。

表2 嵌合體胚胎移植后的妊娠結(jié)局

三、討論

1.胚胎嵌合體：隨著生殖遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用于PGT-A的技術(shù)主要有熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、微陣列比較基因組雜交(aCGH)、微陣列單核苷酸多態(tài)性(aSNP)、定量PCR(qPCR)、二代測序(NGS)等。檢測方法不同，嵌合檢出率也不同。

隨著PGT-A技術(shù)的廣泛使用，研究發(fā)現(xiàn)移植整倍體胚胎可以提高IVF臨床妊娠結(jié)局[9]。在IVF獲得的胚胎中，染色體嵌合較為常見，被認(rèn)為是一些整倍體胚胎移植后失敗的可能原因之一[10]。盡管卵裂期胚胎的嵌合已有報道[11]，但其在囊胚期的發(fā)生率尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)小鼠囊胚期發(fā)生嵌合現(xiàn)象可以被自我糾正[12]，盡管這一現(xiàn)象最初并不被PGS/PGT-A組織廣泛接受[13]，但是Munné[14]認(rèn)為這種自我修正增加的可能性在人類胚胎也有發(fā)生。如果事實確實如此，那么PGS/PGT-A在囊胚階段的檢測將沒有任何意義，因為胚胎在發(fā)育階段的情況并不反映胚胎最終的命運(yùn)。

人類囊胚期胚胎滋養(yǎng)外胚層嵌合現(xiàn)象仍然是目前研究的熱點。單個胚胎多重滋養(yǎng)外胚層活檢顯示嵌合率至少有50%，最高可達(dá)83%[3，15-16]。相同的胚胎，不同實驗室及活檢部位不同，得到的結(jié)果差異也較大[15]。國外一項運(yùn)用aCGH技術(shù)進(jìn)行胚胎檢測的回顧性研究顯示，移植嵌合體胚胎與整倍體胚胎相比，臨床妊娠率下降(26.9% vs. 40.2%)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.127)[17]。Munné等[18]的回顧性研究顯示，復(fù)雜的嵌合體胚胎與非整倍體嵌合胚胎相比，有更低的繼續(xù)妊娠率(10% vs. 50%)；而相比于嵌合率小于40%的胚胎，嵌合率為40%～80%的胚胎其繼續(xù)妊娠率更低(22% vs. 56%)；單體嵌合與三體嵌合之間、整條染色體嵌合與部分片段嵌合之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。相對于嵌合體胚胎移植而言，移植整倍體胚胎的植入率更高、流產(chǎn)率更低、繼續(xù)妊娠率也更高。Spinella等[19]的研究顯示，與整倍體囊胚相比，異常細(xì)胞嵌合比例大于50%的囊胚其臨床妊娠率、著床率和活產(chǎn)率均降低。而另一研究顯示，44枚經(jīng)NGS檢測診斷的嵌合體囊胚中，染色體部分非整倍體嵌合比例低的囊胚與整倍體囊胚的妊娠結(jié)局無明顯差別[20]。在本研究中，嵌合體胚胎移植的臨床妊娠率和著床率均為42.86%，流產(chǎn)率為16.67%；在6例妊娠的患者中，有5例為部分片段嵌合，嵌合比例均小于50%，妊娠結(jié)局良好；而另1例為18號染色體單體嵌合，嵌合比例大于50%，孕8周胚胎停育。研究結(jié)果存在一定差異可能是由于病例數(shù)較少造成的。

2.囊胚質(zhì)量及發(fā)育速度與妊娠結(jié)局：國內(nèi)外的研究認(rèn)為臨床妊娠率與囊胚腔擴(kuò)張程度及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量無關(guān)，而與滋養(yǎng)外胚層有關(guān)[21-22]。孟慶霞等[23]采用多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，影響流產(chǎn)率的兩個重要因素是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分和囊胚發(fā)育天數(shù)，影響活產(chǎn)率的最重要因素是滋養(yǎng)外胚層評分；國外相關(guān)研究[24-25]也證實了這一觀點。柴娟等[26]的研究顯示，凍融囊胚D5組種植率和臨床妊娠率均高于D6組，而早期流產(chǎn)率比D6組低，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。本研究中移植后妊娠的6例嵌合體囊胚中，5例為D5囊胚、1例為D6囊胚，且5例為4級囊胚，僅1例為3級囊胚，囊胚發(fā)育天數(shù)及擴(kuò)張程度與妊娠率有一定關(guān)系。

Minasi等[27]的研究顯示囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分及囊腔擴(kuò)張程度越高，整倍性囊胚的占比也越高，且D5囊胚有更高的整倍體率。孫健等[28]的研究也表明，PGS周期中D5比D6囊胚整倍體率稍高，但沒有顯著差異。Munné等[29]研究認(rèn)為影響胚胎整倍體的因素很多，培養(yǎng)天數(shù)與胚胎整倍體率并無關(guān)系。Capalbo等[30]的雙中心研究顯示，形態(tài)等級及發(fā)育速度不影響整倍體囊胚的種植率，不同質(zhì)量的整倍體囊胚獲得的持續(xù)妊娠率沒有顯著差異，該研究認(rèn)為有必要對所有可利用的囊胚進(jìn)行檢測。

3.PGT-A技術(shù)的局限性：在胚胎發(fā)育過程中，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)組織發(fā)育為胎兒，滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育為胎盤及胎膜等附屬物。囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢理論上不影響胎兒發(fā)育，所以該方法已成為了主流的活檢方法。事實上，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層細(xì)胞之間、滋養(yǎng)層不同部位的細(xì)胞之間可能并不一樣，因此胎盤部位的染色體結(jié)果并不能完全代表胎兒部分的情況。

活檢的細(xì)胞數(shù)要求5～10個，如果胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)量差，活檢的細(xì)胞少，檢測結(jié)果的代表性就越差。另外，目前對于PGT-A，普遍采用低深度測序染色體拷貝數(shù)變異的NGS方法，因此低比例嵌合、小片段缺失及重復(fù)以及結(jié)構(gòu)異常等不在檢測范圍內(nèi)，需要孕中期產(chǎn)前診斷進(jìn)一步行CNV-seq檢測，一旦檢測出異常，及時告知患者行遺傳咨詢。

總之，PGT-A技術(shù)并非無所不能。目前絕大多數(shù)的研究認(rèn)為，嵌合體胚胎具有一定的發(fā)育潛能，盡管與整倍體胚胎相比，其臨床妊娠率較低，但在患者無整倍體胚胎可移植的情況下，經(jīng)遺傳咨詢告知相關(guān)風(fēng)險后可選擇移植嵌合體胚胎，孕中期行產(chǎn)前診斷。PGDIS 在關(guān)于嵌合體胚胎遺傳咨詢指南中建議：(1)相較于二倍體-三倍體細(xì)胞系嵌合胚胎，優(yōu)先移植二倍體-單倍體細(xì)胞系嵌合胚胎；(2)當(dāng)選擇移植二倍體-三倍體細(xì)胞系嵌合胚胎時，應(yīng)根據(jù)嵌合的程度以及受累染色體選擇最優(yōu)胚胎，優(yōu)先考慮移植包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色體的三體嵌合；與單親二倍體(14，15號染色體)相關(guān)嵌合三體胚胎的優(yōu)先級較低；與宮內(nèi)生長遲緩(2，7，16號染色體)相關(guān)嵌合三體胚胎的優(yōu)先級更低；能夠存活(13，18，21號染色體)的嵌合三體胚胎優(yōu)先級最低[31]。本研究的樣本量較少，對于子代安全性問題，還需要更大樣本的長期追蹤隨訪。