EBV相關(guān)性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

林華妹，鄒長(zhǎng)棪，胡 丹，蘇 穎，廖錦容，林可焴，相智聲，鄭雄偉，林賢東,4

胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，病死率居世界第2位[1]。EB病毒(epstein-barr virus, EBV)相關(guān)性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)在全球胃癌病例中占近10%[2]。EBVaGC為胃癌的特殊亞型，與普通胃癌不同，男性好發(fā)，賁門為好發(fā)部位，具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，但其機(jī)制尚不明確[3]。PIWI基因是Argonaute(Ago)基因家族的一個(gè)亞家族，PIWI亞家族成員包括PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3和PIWIL4，主要表達(dá)在睪丸或胚胎組織中[4-6]。近年來(lái)研究表明，PIWI亞家族異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌及結(jié)直腸癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PIWIL基因異常表達(dá)，且與預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。本組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PIWIL1和PIWIL4在胃癌及EBVaGC組織中高表達(dá)，而PIWIL2和PIWIL3未檢測(cè)到[11]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)并探討PIWIL1和PIWIL4基因表達(dá)與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集2012～2018年福建省腫瘤醫(yī)院存檔的111例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，并取相應(yīng)癌旁組織(距癌組織5 cm以上)作為對(duì)照組，患者術(shù)前均未接受過(guò)任何抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為胃腺癌，其中58例為EBVaGC。其中男性88例，女性23例，中位年齡57歲(22.0～80.0歲)。腫瘤直徑中位數(shù)5.8 cm(四分位距1.5～14.5 cm)。按第8版AJCC分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期66例，Ⅳ期10例；根據(jù)Lauren組織學(xué)分型：腸型72例，彌漫型39例。58例EBVaGC中，男性48例，女性10例，中位年齡58歲(22.0～78.0歲)。新鮮組織獲取后立即放入液氮保存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。隨訪時(shí)間從明確診斷開始，至末次隨訪或患者死亡，以月為單位。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入患者均在術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1、EBV陰性胃癌細(xì)胞株MKN-28購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，EBVaGC細(xì)胞株AGS-BX1由香港大學(xué)陳洪霖教授饋贈(zèng)[11]。

1.3 試劑和儀器Trizol購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購(gòu)自Thermo公司，SYBR Green 1 Master購(gòu)自羅氏公司。EBER1檢測(cè)試劑盒(NO.S30172)購(gòu)自福建泰普生物公司。超微量紫外分光光度計(jì)為NanDrop1000；PCR擴(kuò)增儀為Thermo公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀器為羅氏公司產(chǎn)品。原位雜交儀為福建泰普生物公司產(chǎn)品。

1.4 EBV原位雜交檢測(cè)EBVaGC組織主要通過(guò)EBV原位雜交檢測(cè)來(lái)鑒定。EBV原位雜交檢測(cè)采用EBER1檢測(cè)試劑盒(EBV編碼的小核糖核酸1，丹麥Dako公司)。按照EBER1檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行操作：將蠟塊切片、烤片、脫蠟、脫水及蛋白酶K消化約5 min，滴加EBV核酸探針(Epstein-Barr encoded RNA)雜交液，55 ℃孵育90 min，后調(diào)至37 ℃孵育過(guò)夜。加一抗孵育30 min，加二抗孵育20 min。洗滌擦干，滴加辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)30 min；滴加DAB復(fù)合物顯色后蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。

1.5 qRT-PCR取100 mg凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol(德國(guó)QIAGEN公司)，靜置10 min后抽提RNA。收集常規(guī)培養(yǎng)的GES-1、MKN-28和AGS-BX1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同上述方法抽提RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)操作說(shuō)明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR按照SyberGreen(羅氏公司lightCycler480)說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)PIWIL1和PIWIL4分別以T-150246癌組織表達(dá)為基準(zhǔn)標(biāo)本(calibrator)對(duì)其他標(biāo)本進(jìn)行量化，即它的表達(dá)量設(shè)為1，量化其他樣本的表達(dá)量；采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的RQ值，為便于統(tǒng)計(jì)，把RQ值取log10進(jìn)行分析[12-13]。PIWIL1-F-primer：5′-AAGCCAGAAGACTCCGTTCA-3′，PIWIL1-R-primer：5′-TCACATCCTCTCCATTCCGG-3′；PIWIL4-F-primer：5′-CATGAACTACTGGCATCAC-3′，PIWIL4-R-primer：5′-GGGAATTAGACTCTGTTTATC-3′；GAPDH-F-primer：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，GAPDH-R-primer：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；兩組間的比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析，后進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；PIWIL基因表達(dá)和各臨床病理指標(biāo)與EBVaGC胃癌預(yù)后間的相關(guān)性分析先采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)行單因素分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBVaGC鑒定EBV原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，111例胃腺癌中，58例EBER陽(yáng)性，細(xì)胞核呈棕褐色，確認(rèn)為EBVaGC(圖1)。EBVaGC多表現(xiàn)為潰瘍型或凹陷型腫物，具有淋巴上皮瘤樣組織學(xué)、中低分化腺癌伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

圖1 胃癌EBER原位雜交：A.EBV相關(guān)性胃癌EBER呈陽(yáng)性；B.非EBV相關(guān)性胃癌EBER呈陰性

2.2 胃癌中PIWIL1和PIWIL4的表達(dá)利用qRT-PCR檢測(cè)111例胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中PIWIL1和PIWIL4的表達(dá)，胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4的表達(dá)量分別為0.515±0.231和0.766±0.510(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量為0.522±0.153和0.717±0.325，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

為進(jìn)一步分析PIWIL1和PIWIL4表達(dá)與EBV感染的相關(guān)性，依據(jù)EBV感染情況分為EBVaGC組(58例)及非EBV相關(guān)性胃癌(non-EBV-associated gastric cancer, EBVnGC)組(53例)。58例EBVaGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達(dá)量為0.556±0.096和0.778±0.440(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而53例EBVnGC組織中分別為0.245±0.146及0.481±0.342，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關(guān)性胃癌及非EBV相關(guān)性胃癌中的表達(dá)水平：A.PIWIL1；B.PIWIL4；紅線表示每組的平均值

2.3 qRT-PCR法檢測(cè)PIWIL1和PIWIL4在EBVaGC及EBVaGC細(xì)胞株中的表達(dá)58例EBVaGC組織中PIWIL1的平均表達(dá)量為0.556±0.096(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應(yīng)癌旁組織的平均表達(dá)量為0.240±0.121，上調(diào)2.31倍，兩者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033，圖3A)。EBVaGC組織中PIWIL4的平均表達(dá)量為0.778±0.440(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應(yīng)癌旁組織的平均表達(dá)量為0.501±0.431，上調(diào)1.55倍，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029，圖3B)。上述結(jié)果表明PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。53例EBVnGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達(dá)量為0.245±0.146和0.481±0.342(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而相應(yīng)的癌旁組織分別為0.220±0.127及0.453±0.06，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關(guān)性胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平：A.PIWIL1；B.PIWIL4；紅線表示每組的平均值

同時(shí)通過(guò)qRT-PCR法分析正常人胃黏膜細(xì)胞株GES-1、EBV陰性胃癌細(xì)胞株MKN-28及EBVaGC細(xì)胞株AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4的表達(dá)，結(jié)果顯示AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于GES-1和MKN-28，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)

圖4 PIWIL1和PIWIL4在GES-1、MKN-28及AGS-BX1中的表達(dá)水平：***P<0.001

2.4 EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系將58例EBVaGC按照TNM分期分組，Ⅰ+Ⅱ期胃癌組13例，PIWIL1的表達(dá)量為-0.308±0.329；Ⅲ+Ⅳ期胃癌組45例，表達(dá)量為0.383±0.119，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。PIWIL4在Ⅰ+Ⅱ期胃癌組中的表達(dá)量為0.437±0.100，Ⅲ+Ⅳ期胃癌組的表達(dá)量為0.736±0.061，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組12例，PIWIL1的表達(dá)量為-0.338±0.372；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組46例，表達(dá)量為0.377±0.118，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。PIWIL4在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量為0.413±0.115，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量為0.736±0.060，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)。PIWIL1和PIWIL4表達(dá)與EBVaGC患者性別、年齡，組織分化、腫瘤部位、大小、Lauren分型、神經(jīng)侵犯及脈管癌栓均無(wú)相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 EBV相關(guān)性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 PIWIL4表達(dá)與EBVaGC患者預(yù)后的關(guān)系經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，58例EBVaGC中PIWIL4的相對(duì)表達(dá)量lgRQ符合正態(tài)分布，中位數(shù)兩側(cè)數(shù)據(jù)分布均勻，以中位數(shù)為截點(diǎn)的兩組數(shù)據(jù)更具有代表性，故取中位數(shù)0.653為截點(diǎn)，將其分為高表達(dá)量組和低表達(dá)量組。PIWIL4高表達(dá)組29例，死亡20例(69.0%)，平均生存時(shí)間(34.9±6.1)個(gè)月；PIWIL4低表達(dá)組29例，死亡10例(34.5%)，平均生存時(shí)間(56.0±5.9)個(gè)月。采用Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示PIWIL4高表達(dá)組患者的總生存期(overall survival, OS)比低表達(dá)組短(P=0.007，圖5)。而PIWIL1表達(dá)與EBVaGC預(yù)后未見相關(guān)性。

圖5 PIWIL4表達(dá)與EBV相關(guān)性胃癌患者總生存期的關(guān)系

2.6 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型58例EBVaGC中，單因素分析結(jié)果顯示PIWIL4表達(dá)、脈管癌栓及TNM分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)；將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量同時(shí)納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素預(yù)后Logistic回歸分析，結(jié)果顯示PIWIL4表達(dá)為EBVaGC預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P=0.026，表2)。

表2 單因素和多因素的Cox回歸預(yù)后分析結(jié)果

3 討論

EBV是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類致癌病毒，其感染與多種腫瘤相關(guān)，包括淋巴瘤的數(shù)個(gè)亞型以及鼻咽癌等[14-15]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子。EBV在胃癌細(xì)胞中表現(xiàn)為潛伏型Ⅰ感染，感染的胃癌細(xì)胞均可檢測(cè)到EBER的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，感染細(xì)胞呈單克隆增生，提示EBV感染發(fā)生在胃癌發(fā)展的起始階段[16]。近年來(lái)EBVaGC作為一種獨(dú)特的分子亞型疾病逐漸被人們所認(rèn)知，全球胃癌患者中約10%為EBVaGC。目前有很多學(xué)者對(duì)EBV的致癌機(jī)制進(jìn)行了大量研究，證明基因甲基化、突變、擴(kuò)增、失活等可能是其致癌的重要機(jī)制[17]。但對(duì)其研究尚不明確，且尚無(wú)臨床診療規(guī)范與共識(shí)，給我們帶來(lái)新的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

Argonaute蛋白家族是小分子RNA復(fù)合物的主要成分，它分為Ago亞家族和PIWI亞家族。人類PIWI亞家族主要有4個(gè)成員：PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4[18]。PIWI亞家族主要通過(guò)與piRNAs特異性結(jié)合以調(diào)控基因表達(dá)，參與各種生物學(xué)過(guò)程，具體調(diào)控機(jī)制包括基因沉默、轉(zhuǎn)座子沉默、翻譯抑制、表觀遺傳學(xué)改變等[19]。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明PIWI亞家族與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)。Litwin等[20]通過(guò)免疫組化及qPCR研究PIWIL1、PIWIL2在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)及乳腺良性病變組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，PIWIL1和PIWIL2在IDC中表達(dá)水平高于乳腺良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且PIWIL1 mRNA僅在癌組織和乳腺良性病變組織中檢出，而在大多數(shù)正常乳腺組織中均未發(fā)現(xiàn)。Wang等[21]在結(jié)腸腺癌中的研究表明，PIWIL1在癌旁組織(距癌組織5 cm以上)、結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌附近組織中的陽(yáng)性率分別為11.1%(5/45)、53.7%(22/41)和80.4%(74/92)，表達(dá)率遞增，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劉婷等[22]通過(guò)免疫組化分析胃癌及癌旁組織中PIWIL1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：PIWIL1在胃癌組織中的陽(yáng)性率(80.00%)高于癌旁組織(21.33%)(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4 mRNA的表達(dá)水平在癌與癌旁組織中差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC中的表達(dá)高于EBVnGC(P<0.05)；進(jìn)一步分析顯示，EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4的表達(dá)量相比相應(yīng)癌旁組織分別上調(diào)2.31倍和1.55倍(P=0.033，P=0.029)。在胃癌研究中，本組結(jié)果與劉婷等的研究結(jié)果不一致，可能的原因是組織異質(zhì)性、基因表達(dá)與蛋白水平的差異及檢測(cè)方法的敏感性不同等。本組通過(guò)分層分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在胃癌EBVaGC亞型中，PIWIL1和PIWIL4在癌組織中呈高表達(dá)。綜上所述，PIWIL基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，包括EBVaGC。

為進(jìn)一步明確PIWIL表達(dá)與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系，本組分析了PIWIL1和PIWIL4表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，PIWIL1與PIWIL4表達(dá)與EBVaGC組織TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。采用Kaplan-Meier分析，PIWIL4高表達(dá)組患者的OS比低表達(dá)組短(P=0.007)。多因素及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析也表明，PIWIL4表達(dá)可作為EBVaGC OS的獨(dú)立預(yù)后因素，據(jù)此推測(cè)PIWI蛋白過(guò)表達(dá)可能促進(jìn)EBVaGC的侵襲和臨床進(jìn)展。與既往惡性腫瘤相關(guān)的研究結(jié)果一致，例如在胰腺癌中研究表明，PIWIL2表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存期和OS密切相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PIWIL1和PIWIL2表達(dá)與胰腺癌祖細(xì)胞分子亞型相關(guān)的因子呈正相關(guān)，提示PIWIL1和PIWIL2可能是胰腺癌潛在的預(yù)后分子指標(biāo)[23]。在腎透明細(xì)胞癌研究顯示，癌組織中PIWIL1、PIWIL2和PIWIL4表達(dá)高于癌旁組織，且PIWIL1和PIWIL4異常表達(dá)與臨床分期及生存率顯著相關(guān)[24-25]。以上結(jié)果提示，PIWIL表達(dá)與多種腫瘤的臨床進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)，可能是潛在的預(yù)后分子指標(biāo)。

綜上所述，EBVaGC是具有獨(dú)特分子表型的胃癌，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EBVaGC癌組織PIWIL1和PIWIL4過(guò)表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，且PIWIL4與OS相關(guān)，是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上表明PIWIL4參與了EBVaGC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，PIWIL4有望作為EBVaGC預(yù)后的重要分子標(biāo)志物，并可能成為EBVaGC治療新的靶點(diǎn)。