權(quán)勤波，宋建建，陳淑梅，孫俊英

(1.東營市食品藥品檢驗中心，山東 東營 257091；2.東營市河口區(qū)市場監(jiān)督管理局，山東 東營 257200)

紫蘇子為唇形科植物紫蘇[Perillafrutescens(L.)Britt.]的干燥成熟果實,始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品。具有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便的功效[1]。用于痰雍氣逆、咳嗽氣喘、腸燥便秘[2]，常被應(yīng)用于中藥制劑如蘇子降氣丸[3]、橘紅丸[4]、橘紅化痰丸等，歷版《中國藥典》中紫蘇子有效成分僅收載了迷迭香酸單成分含量測定，目前研究文獻(xiàn)顯示，其活性成分檢測僅包含迷迭香酸單成分[5]或迷迭香酸與熊果酸[6]，或與木犀草素等雙成分的測定[7]，為了更安全有效快速的控制紫蘇子的質(zhì)量，本文研究建立迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷同時測定的高效液相色譜法方法，該法簡單，快捷，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，實用性強(qiáng)，可更好的評價其整體質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型液相色譜儀、XS205DU電子分析天平、KQ-500B型超聲波清洗器，甲醇為色譜純試劑，水為純化水，其他試劑為分析純。迷迭香酸(批號：111871-201706，純度：90.5%)、芹菜素對照品(批號：111901-201603,純度：99.2%，置五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h后使用)、木犀草苷對照品(批號：111720-201408,純度：94.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院，紫蘇子樣品(經(jīng)中魯醫(yī)院邵林主任鑒定)均購自當(dāng)?shù)厮幏俊?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent Eclipse C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以0.1%冰醋酸溶液為流動相A,以甲醇為流動相B，梯度洗脫見表1，進(jìn)樣體積10 μL，檢測波長320 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，色譜圖見圖1～2。

表1 梯度洗脫時間表

1.迷迭香酸;2.芹菜素;3.木犀草苷

1.迷迭香酸;2.芹菜素;3.木犀草苷

2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過二號篩)約1.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇約20 mL超聲處理(功率250 W，頻率 40 kHz)30 min，取出，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對照品16.11 mg、芹菜素對照品14.75 mg、木犀草苷對照品14.95 mg分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，搖勻，作為對照品儲備液備用。按需用甲醇稀釋至相應(yīng)的濃度。

分別精密量取上述3種對照品溶液各5 mL，用甲醇稀釋并定容至50 mL容量瓶中，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.4 條件的優(yōu)化

2.4.1 色譜條件的優(yōu)化 本試驗比較了甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸流動相的分離效果。流動相為甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%磷酸時，對照品色譜圖中，目標(biāo)成分不能完全分離；采用乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸作流動相，不斷調(diào)整比例，供試品中迷迭香酸不能達(dá)到基線分離，且拖尾嚴(yán)重；采用甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-0.1%冰醋酸，在合適的梯度條件下，對照品色譜圖中，目標(biāo)成分能夠完全分離，峰形對稱，但考慮到甲醇毒性較乙腈更小，冰醋酸更安全，故選用甲醇-0.1%冰醋酸為流動相，梯度洗脫。

2.4.2 波長的優(yōu)化 通過DAD檢測供試品所有波長的吸收情況，綜合比較220、268、320、365 nm各波長的峰強(qiáng)度、峰數(shù)量與保留時間，最終選擇320 nm為檢測波長。

2.4.3 提取溶劑的選擇 查閱文獻(xiàn)[8]，甲醇超聲處理即可將3種成分全部提取，試驗證明，干擾峰較少，故選擇甲醇作為溶劑。

2.4.4 提取方法的優(yōu)化 采用甲醇加熱回流30 min、1 h、2 h、3 h與甲醇超聲30、45 min對比提取方法，發(fā)現(xiàn)加熱回流2 h后，有效成分溶出量增加較少，但相比甲醇超聲30 min的溶出量幾近相等，故選擇時間成本低、操作簡單、且可批量試驗的超聲30 min為提取方法。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系 精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、20、50 μL注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果在相應(yīng)進(jìn)樣范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(見表2)。

表2 線性關(guān)系試驗結(jié)果(n=6)

2.5.2 精密度試驗 精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分別為0.33%、0.14%、0.27%(n=5)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分別為0.68%、0.12%、0.49%(n=6)。試驗結(jié)果表明，供試品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品6份，照“2.2”項下方法制備供試品液，進(jìn)樣10 μL測定峰面積，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷RSD分別為0.81%、0.54%、0.48%(n=6)。表明分析方法重現(xiàn)性好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取6份已測知迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷含量的紫蘇子S5樣品粉末(過二號篩)約0.75 g，精密稱定，分別置于6個25 mL容量瓶中，分別準(zhǔn)確加入對照品溶液：迷迭香酸5 mL(0.583 mg·mL-1)、芹菜素10 mL(0.058 5 mg·mL-1)、木犀草苷5 mL(0.059 6 mg·mL-1)，再分別用甲醇定容至25 mL，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL測定峰面積，計算回收率，迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷的平均回收率(n=6)分別為99.84%，RSD為0.25%；99.83%，RSD為0.77%；98.39%，RSD為1.07%，結(jié)果分別見表3～5。

表3 迷迭香酸加樣回收率測定結(jié)果

表4 芹菜素加樣回收率測定結(jié)果

2.6 樣品測定 取樣品，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液及對照品溶液各10 μL進(jìn)樣測定峰面積，用外標(biāo)法(峰面積)計算含量，結(jié)果見表6。

表5 木犀草苷加樣回收率測定結(jié)果

表6 樣品含量測定結(jié)果(%)(n=3)

3 討論

3.1 本試驗分別考察了流動相類型、流動相不同比例的洗脫效果，最終篩選出甲醇-0.1%冰醋酸溶液梯度洗脫系統(tǒng)適用性試驗良好，在同一體系同時測定3種成分的色譜條件,并采取了簡單的超聲處理30 min處理方法，大大降低了提取時間,且毒性較小，3種成分在20 min內(nèi)全部完全分離，降低了分析時間，本方法簡便、快速、可靠，適用于紫蘇子的藥材質(zhì)量分析。

3.2 采用HPLC法首次檢出木犀草苷，借助于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)可準(zhǔn)確定量，為更全面控制紫蘇子質(zhì)量提供參考。

3.3 紫蘇子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有迷迭香酸單成分分析，控制其質(zhì)量專屬性不強(qiáng)。本試驗采用HPLC法同時測定紫蘇子中迷迭香酸、芹菜素、木犀草苷的含量，5批樣品3個成分均有檢出，含量范圍迷迭香酸0.257%～0.437%，芹菜素0.012%～0.082%，木犀草苷為0.024%～0.046%，該法回收率高，分離效果好，操作簡便，方法可行，同時，從含量看出，紫蘇子質(zhì)量差異較大，本研究為標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

3.4 首次利用普通高效液相色譜儀建立紫蘇子中迷迭香酸、木犀草苷、芹菜素同時測定法，5批次樣品含量存在較大差異，但本方法均可對其含量進(jìn)行定量控制，是完善藥品標(biāo)準(zhǔn)，確保用藥安全有效尤為重要的方法。