稻花香馫香型白酒酒曲酶活測(cè)定與高通量測(cè)序分析

崔雨欣，蔡開云，陳 萍，申登晉，曾宇倫，譚光迅，趙述淼

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北宜昌 443100）

大曲是傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造的物質(zhì)基礎(chǔ)。大曲是以大麥、小麥、豌豆等為原料，經(jīng)粉碎、加水混捏、壓成曲醅并在人為控制的一定溫度和濕度條件下形成大小不一的塊狀物。作為糖化發(fā)酵劑，大曲含有豐富的微生物群落、功能酶系及在制曲過(guò)程中形成的風(fēng)味前體物質(zhì)，是白酒質(zhì)量和產(chǎn)量的重要保障[1-2]。在大曲的制作過(guò)程中溫度是一項(xiàng)重要的指標(biāo)，根據(jù)品溫的不同，大曲可分為低溫大曲、中溫大曲、中高溫大曲和高溫大曲。小曲是用米粉、米糠或麩皮，有的添加中草藥或觀音土，接入定量的母曲，在一定溫濕度條件下制成的[3]。小曲作為同樣重要的糖化發(fā)酵劑，是小曲白酒香氣的主要來(lái)源。根霉曲實(shí)質(zhì)上是純種小曲[4]，將純種根霉菌和酵母菌分開培養(yǎng)并按一定比例混合制成釀酒所用根霉曲，從而使小曲的質(zhì)量顯著提高[5]。在糖化階段根霉曲按一定比例與蒸泡攤晾后的原料混合并加入，促進(jìn)糖化的順利進(jìn)行，具有出酒率高，酒質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

馫香型白酒是湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司開發(fā)一種創(chuàng)新型酒體。它的釀造工藝包括糖化培菌、高溫堆積、入窖發(fā)酵等過(guò)程，有效地結(jié)合了小曲清香型白酒的糖化培菌，醬香型白酒的高溫堆積以及濃香型白酒泥窖發(fā)酵的工藝特點(diǎn)，進(jìn)而形成了獨(dú)特的馫香型白酒生產(chǎn)工藝，具體為：蒸煮后的高粱加小曲進(jìn)行培菌糖化，隨后糖化好的酒醅配糟后加入高溫大曲進(jìn)行高溫堆積，最后堆積好的酒醅加入中高溫大曲，進(jìn)入泥窖開始發(fā)酵（圖1）。目前尚不清楚稻花香馫香型白酒釀造使用的3 種曲——根霉曲、中高溫大曲和高溫大曲的酶活力和微生物數(shù)量及組成，本研究測(cè)定了它們的酶活力和微生物數(shù)量，并進(jìn)行了高通量測(cè)序，為馫香型白酒的生產(chǎn)及工藝改造提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：取自稻花香酒業(yè)生產(chǎn)的根霉曲（GM）、中高溫大曲（ZGW）和高溫大曲（GW），每種酒曲取3個(gè)批次。

培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。

1.2 理化性能的測(cè)定

酯化力、糖化力、液化力和酸性蛋白酶活力的測(cè)定均參照沈怡方《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[6]所示的方法。

1.3 微生物數(shù)量的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的稀釋平板涂布法測(cè)定酒曲中的微生物數(shù)量。利用孟加拉紅培養(yǎng)基計(jì)數(shù)酵母菌和霉菌，利用LB 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)細(xì)菌和芽孢桿菌。其中計(jì)數(shù)芽孢桿菌時(shí)先將稀釋好的樣品液置于80 ℃水浴15 min后再進(jìn)行涂布[7]。

1.4 高通量測(cè)序

將3 種酒曲樣品提取DNA 并進(jìn)行高通量測(cè)序（美吉測(cè)序公司，上海），OTU[8]（Operational Taxonomy Unit）分析、Alpha 多樣性分析[9]及物種注釋均通過(guò)美吉生物科技有限公司云平臺(tái)進(jìn)行（https://cloud.majorbio.com/），試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著水平，標(biāo)注各組差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)

根霉曲、中高溫大曲和高溫大曲的各項(xiàng)理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 不同工藝曲理化指標(biāo)

由表1 可知，3 種曲的糖化力具有明顯差異，中高溫大曲糖化力最高；根霉曲的液化力、酸性蛋白酶活力和酯化力最高，與其他兩種曲差異性顯著，分別達(dá)16.36 U/g、189.32 U/g和164.69 mg/g。

2.2 微生物計(jì)數(shù)

采用傳統(tǒng)的稀釋平板涂布法對(duì)酒曲中的霉菌、酵母菌、細(xì)菌和芽孢桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種曲中不同種類微生物數(shù)量

計(jì)數(shù)結(jié)果表明，高溫大曲和中高溫大曲的酵母菌數(shù)量差異不顯著，而根霉曲中沒(méi)有檢測(cè)到酵母；中高溫大曲和根霉曲的霉菌數(shù)量顯著高于高溫大曲，超出一個(gè)數(shù)量級(jí)；中高溫大曲芽孢桿菌顯著高于高溫大曲，總細(xì)菌無(wú)顯著差異，而根霉曲中未檢測(cè)到細(xì)菌和芽孢桿菌。

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果

2.3.1 樣品多樣性

對(duì)稻花香馫香型白酒酒曲樣品的細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，中高溫大曲和高溫大曲細(xì)菌的Shannon 指數(shù)都大于1，與根霉曲有顯著差異。而3 種曲真菌群落的Shannon 指數(shù)都具有明顯差異性，其中中高溫大曲的Shannon指數(shù)最高。

表3 細(xì)菌和真菌群落的Shannon指數(shù)表

2.3.2 高通量測(cè)序分析微生物群落組成

在門水平和屬水平上分別計(jì)算了各樣本的細(xì)菌群落的物種平均相對(duì)豐度（n=3），如圖2 所示。（1）高溫大曲（GW）在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群（平均相對(duì)豐度＞1%）包括Firmicutes（厚壁菌門，50.13%），Proreobacteria（變形菌門，33.13%）和Actinobacteria（放線菌門，15.84%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，32 %），Kroppenstedtia（21.6 %），Saccharopolyspora（糖多孢菌屬，18.06 %），Thermoactinomyces（高 溫 放 線 菌 屬，9.01 % ），Norank_f_Pseudonocardiaceae（4.93 %），Planifilum（3.4 %），Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.13 %）和Pediococcus（片球菌屬，1.75 %）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群有Firmicutes（厚壁菌門，50.76%），Proteobacteria（變形菌門，21.21%）和Actinobacteria（放線菌門，14.81%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，17.96 %），Kroppenstedtia（16.23 %），Thermoactinomyces（高溫放線菌屬，8.73%），Weissella（魏斯氏菌屬，5.48%），Lactobacillus（乳桿菌屬，3.8 %），Pediococcus（片球菌屬，2.46 %），Planifilum（1.96 %）和Staphylococcus（葡萄球菌屬，1.69%）。（3）根霉曲在目水平未分類。

圖2 樣品門水平（A）和屬水平（B）的細(xì)菌豐度比例圖

在門水平和屬水平上分別計(jì)算了各樣本的真菌群落的物種平均相對(duì)豐度（n=3），如圖3 所示。（1）高溫曲（GW）在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群（平均相對(duì)豐度＞1 %）為Ascomycota（子囊菌門，99.86 %），在屬水平上有Thermomyces（嗜熱真菌屬，79.49 %），Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，13.98 %），Aspergillus（曲霉菌屬，1.91 %）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群有Ascomycota（子囊門，86.27%），Mucoromycota（毛霉門，5.46%）和Basidiomycota（擔(dān)子菌門，8.19 %）；在屬水平上有Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，62.72 %），Thermomy-ces（嗜熱真菌屬，4.53 %），Cutaneotrichosporon（5.56%），Candida（假絲酵母屬，3.53%），Rhizopus（根霉菌屬，5.36 %），Aspergillus（曲霉菌屬，3.04 %），Hyphopichia（2.29 %），Trichomonascus（2.29 %）和Xeromyces（耐干霉菌屬，1.89 %）。（3）Rhizopus（根霉菌）作為根霉曲中的優(yōu)勢(shì)菌種，豐度達(dá)99.99%。

圖3 樣品門水平（A）和屬水平（B）真菌豐度比例圖

2.4 物種Venn圖

Venn 圖能夠得到不同樣品之間相同的物種組成，3 種曲的Venn 圖分析如圖4 所示。3 種曲共有的細(xì)菌屬有25 種，中高溫大曲和高溫大曲共有的細(xì)菌屬有185 種，中高溫大曲和高溫大曲分別與根霉曲的物種重合有37 和26 種。其中，中高溫大曲物種最為豐富，達(dá)591 種，高溫大曲210 種，而根霉曲只有41 種。3 種曲共有的真菌屬有4 種，中高溫大曲和高溫大曲共有39 種。其中物種最多的是中高溫大曲96 種，而高溫大曲和根霉曲分別只有49種和5種。

圖4 樣品屬水平細(xì)菌（A）和真菌（B）venn圖

3 討論

作為白酒釀造過(guò)程中起重要作用的液化酶和糖化酶，直接影響著原料中淀粉的轉(zhuǎn)化效率及出酒率。酸性蛋白酶可以分解原料中的大分子蛋白，為微生物生長(zhǎng)提供氮源，促進(jìn)發(fā)酵[10-12]。酯化力是大曲自身經(jīng)發(fā)酵成熟后固有的催化醇和羧酸生成酯的能力，而生成的酯是濃（醬）香型白酒重要的主體香味物質(zhì)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，中高溫大曲的糖化力更高；根霉曲的酸性蛋白酶活和酯化力大于高溫大曲和中高溫大曲。因此3 種曲在稻花香馫香型白酒釀造的不同階段加入，不僅有利于提高出酒率，還有利于馫香型香氣的形成。

大曲微生物代謝產(chǎn)生的乙醇和各種風(fēng)味物質(zhì)，是白酒的關(guān)鍵組分。本研究首先使用平板計(jì)數(shù)測(cè)定微生物數(shù)量，結(jié)果表明，中高溫大曲的霉菌、酵母菌、芽孢桿菌以及總細(xì)菌數(shù)量高于高溫大曲。微生物計(jì)數(shù)雖然對(duì)微生物進(jìn)行了絕對(duì)定量，并側(cè)面反映了大曲中微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)，但由于僅僅反映的是可培養(yǎng)微生物，且受環(huán)境中的溫度、濕度和氣候等因素影響很大,因此，對(duì)大曲微生物的認(rèn)識(shí)存在很大的局限性。本研究針對(duì)上述問(wèn)題，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析了稻花香馫香白酒3 種酒曲微生物群落多樣性及組成。在測(cè)定的3 種酒曲中，根霉曲的Shannon 指數(shù)最小，其中根霉菌的相對(duì)豐度達(dá)99.99 %，而中高溫大曲相比高溫大曲和根霉曲而言，其細(xì)菌和真菌群落的Shannon 指數(shù)更高，具有更高的物種豐富度和均勻度，并且在屬水平上擁有近600 種細(xì)菌，真菌也有將近100 種。這可能是由于高溫大曲的品溫過(guò)高，引起不耐高溫微生物在制曲過(guò)程中死亡；而根霉曲采用的是純種制曲，基本以根霉菌為主，也包括極少量來(lái)自環(huán)境及工具的細(xì)菌。

制曲溫度影響著大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。本研究發(fā)現(xiàn)，中高溫大曲和高溫大曲細(xì)菌群落都由Bacillus（芽孢桿菌屬）占主導(dǎo)地位，豐度分別為17.96%和32%，側(cè)面印證了傳統(tǒng)稀釋涂平板法中芽孢桿菌占總細(xì)菌的絕大多數(shù)的結(jié)果。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)中高溫大曲的細(xì)菌相較于高溫大曲而言，Thermoactinomyces（高溫放線菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬）明顯下降。芽孢桿菌產(chǎn)多種蛋白酶，是大曲中風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源。高溫放線菌屬常見(jiàn)于自然界高溫場(chǎng)所，具備耐高溫特性，適應(yīng)大曲發(fā)酵中的高溫環(huán)境，具備開發(fā)高溫淀粉酶、蛋白酶、酯酶、脫氫酶和多酚氧化酶等潛力[14]。在真菌群落組成中，Thermomyces（嗜熱真菌屬）在高溫大曲的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于中高溫大曲（4.53 %），達(dá)79.49 %。而Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）作為中高溫大曲中占主導(dǎo)地位的真菌屬，相對(duì)豐度達(dá)62.72%，遠(yuǎn)高于高溫大曲中的豐度（13.98%）。嗜熱真菌屬產(chǎn)木聚糖酶和蛋白酶等酶類，李欣等[15]發(fā)現(xiàn)嗜熱真菌屬是酒醅發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酶的主要功能菌。嗜熱子囊菌產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶，可降解糖類和蛋白質(zhì)等并具有良好的熱穩(wěn)定性,有利于大曲產(chǎn)酒生香作用[16]。兩種大曲擁有不同的微生物群落組成，可能是由于不同的制曲溫度引起的：高溫大曲培菌溫度在63～68 ℃之間，中高溫大曲培菌溫度在55～60 ℃之間。根霉曲中，根霉菌產(chǎn)糖化酶、液化酶、蛋白酶和脂肪酶，還能產(chǎn)生各種有機(jī)酸，可為其他微生物的代謝提供基礎(chǔ)物質(zhì)，對(duì)整個(gè)糖化發(fā)酵過(guò)程以及白酒的風(fēng)味都具有一定影響。

本研究系統(tǒng)性地檢測(cè)分析了稻花香酒廠用于馫香型白酒釀造的3 種曲（中高溫大曲、高溫大曲和根霉曲）中微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)曲樣的酶學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)單分析了酒曲中細(xì)菌真菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的差異和酶活力之間的關(guān)系，為優(yōu)化稻花香酒曲工藝、提高酒曲質(zhì)量提供了參考依據(jù)，具有理論和實(shí)踐意義。