鮮切火龍果低溫貯藏期間游離態(tài)和結合態(tài)香氣物質的變化

張 琴，周丹丹，韓 璐，龍家美，屠 康

（南京農業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

火龍果（Hylocereus undatus）又名仙蜜果、紅龍果，為仙人掌科（Cactaceae），三角柱屬（Hylocereus）或西施仙人柱屬（Selenicereus）植物，按果皮果肉顏色主要分為紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉3 大類[1-2]。成熟火龍果果肉細膩多汁，味道香甜、色澤鮮亮誘人，富含人體所需的多種營養(yǎng)成分。包括一般植物少有的植物性蛋白、豐富的礦物質和水溶性膳食纖維，還含有具有抗氧化、抗炎、清除自由基等生物活性的酚類、黃酮、甜菜花青素等物質，具有極高的營養(yǎng)價值[3-5]。3 種類型火龍果中，紅肉火龍果由于其誘人的感官特性，富含對人體健康有益的β-花青苷、甜菜堿和多酚等營養(yǎng)物質以及高度經濟性，且符合現(xiàn)代消費者對健康的追求，在世界范圍內受到越來越多的關注[6-8]。由于火龍果體積相對較大，因此鮮切產品可能更方便消費者食用[9]。近年來，隨著鮮切果蔬的市場化，公眾對鮮切產品的需求不斷增加，鮮切火龍果因其新鮮、營養(yǎng)、快捷和衛(wèi)生等特點深受消費者喜愛。

香氣是影響果實風味品質的重要因素。目前，已有研究在火龍果中鑒定出34 種香氣物質，主要包括醛類、碳氫化合物、醇類、酮類、酯類和呋喃類物質，其中醛類是含量最豐富的揮發(fā)性化合物[10]。水果中香氣物質除了以具有揮發(fā)性的游離態(tài)形式存在外，還有部分以結合態(tài)形式存在。結合態(tài)香氣物質是一種不具揮發(fā)性，與水果中的糖類物質通過糖苷鍵結合，且多數(shù)以β-糖苷鍵連接以糖苷形式存在的香氣前體物質，這類物質經過酶解或酸解釋放后，可以從水果中揮發(fā)出來[11-12]。由于結合態(tài)香氣物質貯存在液泡中，而相關的水解酶貯存在細胞質中，這些物質在完整果實中很少釋放香氣成分。鮮切水果在去皮、去核和切分等加工程序中，必然會造成組織破損、細胞破裂，使細胞中的區(qū)域化空間被打破，相應的水解酶和底物接觸，導致糖苷類風味化合物釋放香氣成分[13]。目前，對火龍果香氣的研究主要集中在采后處理對火龍果游離態(tài)香氣物質的影響，但鮮切對火龍果中結合態(tài)香氣物質影響鮮見報道。

因此，本實驗以“密寶”火龍果為試材，研究鮮切對火龍果香氣的影響并對鮮切火龍果在4 ℃貯藏期間游離態(tài)和結合態(tài)香氣物質的變化進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“密寶”火龍果（Hylocereus undatuscv.Mibao），采購于南京眾彩物流中心，立即運回實驗室進行預冷；β-葡萄糖苷酶、葡萄糖、D-果糖標準品 上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、甲醇和二氯甲烷等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C MSD氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、Model 1260高效液相色譜系統(tǒng)、HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；CTHI-250B型恒溫恒濕箱施都凱儀器設備（上海）有限公司；HH-4恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；Varioskan Flash型酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；氮吹儀 上海允延儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；SPE LC-18固相萃取柱（500 mg/6 mL） 德國CNW公司。

1.3 方法

1.3.1 果實的處理

火龍果經預冷后，挑選大小、成熟度一致，外表完整且無機械損傷的火龍果進行鮮切處理。將火龍果去皮并切除兩頭最頂端，先橫切成厚度約1 cm的圓片，再將圓片以十字形切成4 瓣扇形小塊。鮮切火龍果隨機用保鮮盒進行分裝，每盒稱取約150 g，置于4 ℃恒溫恒濕箱貯藏。分別對全果（0 h）、鮮切后貯藏1 h、1 d、3 d、5 d和7 d的樣本進行取樣，每個取樣點隨機取3 盒樣品進行取樣，果肉切碎后立即用液氮研磨，置于－80 ℃超低溫冰箱。

1.3.2 可溶性固形物、可滴定酸的測定

可溶性固形物含量：采用PAL-1型數(shù)顯折光儀測定；可滴定酸含量：采用酸度計測定。

1.3.3 可溶性糖含量的測定

參照Li Xiaoan等[14]的方法并稍作修改。稱取6 g在液氮中研磨成的火龍果粉末，加入30 mL 80%乙醇溶液在80 ℃水浴中提取1 h，20 ℃、10 000 r/min離心15 min后取上清液25 mL通過旋轉蒸發(fā)濃縮（50 ℃）以除去乙醇，并加入20 mL超純水稀釋提取到的可溶性糖。用0.45 μm微孔膜過濾，過濾后的溶液用于可溶性糖分析?？扇苄蕴峭ㄟ^配備有蒸發(fā)光散射檢測器的高效液相色譜系統(tǒng)進行分析，進樣20 μL，經過氨基柱分離（柱溫40 ℃）后于檢測器進行測定。流動相采用乙腈-超純水（75∶25，V/V），流速0.8 mL/min。

1.3.4 游離態(tài)香氣物質的萃取

參照Wu Qixian等[15]的方法并稍作修改。稱取5 g液氮研磨后的火龍果粉末放入20 mL的頂空瓶中，加入0.6 g NaCl以促進香氣揮發(fā)，再加入10 μL內標物3-辛醇，立即用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊密封。置于45 ℃水浴鍋內平衡10 min后使用預先老化的萃取頭插入頂空瓶上方萃取40 min，縮回纖維頭，立即插入進樣口解吸5 min。

1.3.5 結合態(tài)香氣物質的提取和酶解

參照Gao Jie等[16]的方法并稍作修改。稱取液氮研磨后的火龍果粉末6 g，加30 mL蒸餾水溶解，混勻后在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，得到上清液。準確量取25 mL上清液流經用10 mL甲醇和10 mL蒸餾水處理過的固相萃取柱，接著用25 mL蒸餾水洗去水溶性糖、酸等。然后用25 mL二氯甲烷洗脫游離態(tài)香氣物質，接著用25 mL甲醇洗脫結合態(tài)香氣物質，收集甲醇部分，在旋轉蒸發(fā)器上（水浴溫度35 ℃）濃縮至1～2 mL，接著氮吹至干。加入1.8 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 5，0.2 mol/L）溶解結合態(tài)香氣物質，再用9 mL二氯甲烷分3 次萃取以除去可能殘留的游離態(tài)香氣物質，得到的水相即為結合態(tài)香氣組分。準確稱取15 mgβ-葡萄糖苷酶（15 U/mg）至水相，在37 ℃水浴48 h，結合態(tài)香氣物質轉化為游離態(tài)形式。加入10 μL的3-辛醇作為內標。將釋放后的游離揮發(fā)物萃取后進行氣相色譜-質譜分析。

1.3.6 氣相色譜-質譜測定

氣相色譜條件：HP-5石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升至200 ℃，保持1 min；載氣（He）流量為1.0 mL/min；采用不分流模式進樣。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助加熱溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～450。

1.3.7 香氣物質的定性定量分析

定性：未知化合物的定性通過與NIST文庫（NIST 2008）進行比較，并結合人工圖譜分析以確定各化學成分。

定量：采用內標法。以3-辛醇作為內標，按下式計算：

1.3.8β-葡萄糖苷酶活性的測定

參照Garcia等[17]的方法并作修改。稱取1 g在液氮中研磨成的粉末加入5 mL含有0.15 g聚乙烯吡咯烷酮的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液（pH 5.5，0.1 mol/L）中，于4 ℃提取30 min。之后將提取液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

在試管中依次加入0.6 mL粗酶液、0.1 mL對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（10 mmol/L）溶液和0.3 mL經預冷的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液（pH 5），37 ℃孵育90 min，然后立即加入1 mL的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，在對-硝基苯酚的最佳吸收波長402 nm處測吸光度，以加熱失活的酶液做同樣處理作為對照，單位為U/g，以鮮質量計。1 U定義為在37 ℃條件下1 min內催化生成1 nmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 可溶性固形物、可滴定酸的變化

絕大多數(shù)的香氣物質是植物次生代謝的產物，次生代謝的進行是以初生代謝為基礎，而可溶性固形物主要是由植物初生代謝產物構成[18]。如圖1所示，火龍果進行鮮切后，可溶性固形物質量分數(shù)顯著上升，由最初的9.94%上升至12.17%，低溫貯藏期間可溶性固形物含量呈波動性變化，且變化幅度較小?？傻味ㄋ岷吭谫A藏期呈現(xiàn)波動性變化，第3天降至最低值后第5天又有所上升，第7天含量又有所下降。

圖1 鮮切火龍果在低溫貯藏下可溶性固形物（A）和可滴定酸（B）含量變化Fig.1 Changes of soluble solid (A) and titratable acid (B) contents in fresh-cut pitaya stored at low temperatures

2.2 可溶性糖含量變化

由圖2可知，火龍果中不含蔗糖，葡萄糖和果糖是火龍果主要的可溶性糖，且葡萄糖含量很高，是果糖含量的3 倍左右。火龍果在鮮切后與全果相比，葡萄糖和果糖含量顯著上升。鮮切火龍果中葡萄糖含量在第1天達到最高值（79.71 mg/g）后持續(xù)下降，果糖含量在第3天達到最高值（31.65 mg/g）后呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3 游離態(tài)香氣物質含量變化

如圖3、表1所示，全果和鮮切火龍果中共檢測到24 種游離態(tài)香氣物質，主要包括5 種萜烯類、4 種醇類、9 種醛類、3 種酮類和3 種酯類物質。醛類和萜烯類物質是火龍果果實中主要的香氣物質，其中醛類物質占總香氣物質含量的70%～80%。

圖3 火龍果中游離態(tài)香氣物質總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of free volatile compounds in pitaya

表1 鮮切火龍果在低溫貯藏期間游離態(tài)香氣物質含量變化Table 1 Changes of free volatile compounds in fresh-cut pitaya during low storage temperatures

火龍果進行鮮切后，游離態(tài)香氣物質含量顯著上升，低溫貯藏1 d后，游離態(tài)香氣物含量逐漸下降。（＋）-α-長葉蒎烯、（＋）-長葉環(huán)烯、環(huán)苜蓿烯、長葉烯和（＋）-檸檬烯是檢測到的萜烯類物質，是火龍果中重要的香氣物質，其中（＋）-α-長葉蒎烯、（＋）-長葉環(huán)烯具有木香味，長葉烯具有濃郁的松香味，約占總萜烯類物質含量的70%?；瘕埞r切后，所有檢測到的萜烯類物質含量均顯著上升，低溫貯藏1 d后，萜烯類物質含量均呈現(xiàn)顯著性下降趨勢，貯藏期間含量變化不顯著。4-甲基-1-戊醇、脫氫香葉醇、正庚醇、1-辛醇是火龍果中檢測到的4 種醇類物質，含量均在鮮切后達到最高值，貯藏1～7 d含量呈現(xiàn)下降趨勢。正己醛是醛類物質中含量最高的物質，約占總醛類物質的80%。醛類物質含量在火龍果進行鮮切后達到最高值，為214.28 μg/kg，其中正己醛、2-己烯醛和2,4-己二烯醛均具有青草香味，是火龍果重要的風味物質，三者含量均在鮮切后顯著上升，低溫貯藏期間含量有所下降。3-辛酮、5-甲基-3-庚酮和雙環(huán)丙基酮是檢測到的3 種酮類物質，含量也均在切片貯藏1 h后達到最高值，后期低溫貯藏期間含量變化不顯著。酯類是果實中重要的香氣物質，本研究在火龍果中檢測到3 種酯類物質，總含量也在火龍果進行切分后達到最高值，后期貯藏期間總含量呈現(xiàn)波動性變化。

2.4 結合態(tài)香氣物質含量變化

由圖4與圖3相比可知，火龍果中游離態(tài)和結合態(tài)香氣物質組分和含量差異較大。由表2可知，全果和鮮切火龍果中共檢測到17 種結合態(tài)香氣物質，主要包括3 種萜烯類、6 種醇類、4 種醛類、2 種酮類和2 種酯類物質。結合態(tài)香氣物質含量較高的有3,4-二甲基苯甲醛、5-甲基水楊酸甲酯、橙花醛和香葉醛。

圖4 火龍果中結合態(tài)香氣物質總離子流圖Fig. 4 Total ion current chromatogram of bound volatile compounds in pitaya

book=148,ebook=166

表2 鮮切火龍果在低溫貯藏期間結合態(tài)香氣物質含量變化Table 2 Changes of bound volatile compounds in fresh-cut pitaya during low storage temperatures

結合態(tài)香氣物質在第1天含量達到最高值 （200.07 μg/kg），第3天含量顯著下降，貯藏后期含量變化不大。以萜烯類物質為配基的糖苷鍵合態(tài)物質是火龍果中重要的一類結合態(tài)香氣物質，萜烯類糖苷配基易與糖類物質結合形成鍵合態(tài)物質。反式-芳樟醇氧化物、橙花醛和香葉醛是檢測到的3 種萜烯類結合態(tài)香氣物質，在鮮切火龍果貯藏期間均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。苯乙醇、2-乙基己醇和6-甲基-3-庚醇是含量較高的3 種結合態(tài)醇類物質，火龍果進行鮮切后，這3 種物質含量顯著下降。總的結合態(tài)醇類物質在火龍果切分后達到最低值（12.41 μg/kg），在后續(xù)貯藏階段變化不顯著。苯乙醛是唯一以兩種形式存在的醛類香氣物質，具有玉簪花香味，且其結合態(tài)含量是游離態(tài)含量的3 倍左右。結合態(tài)醛類物質第1天含量達到最高值后呈現(xiàn)下降趨勢。 3-辛酮和2-十一酮是檢測到結合態(tài)酮類物質，在火龍果切分后，總酮含量顯著下降，在鮮切火龍果低溫貯藏期間兩者均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。5-甲基水楊酸甲酯是羥基酯類，易與糖結合形成結合態(tài)物質，是所有結合態(tài)香氣物質中含量最高的物質，在鮮切火龍果貯藏1 d后含量達到最高值（134.78 μg/kg）。

2.5 β-葡萄糖苷酶活性的變化

β-葡萄糖苷酶是參與果實中結合態(tài)香氣物質向游離態(tài)香氣物質轉變的主要水解酶。由圖5可知，鮮切火龍果進行鮮切處理后，β-葡萄糖苷酶活性急劇上升，由全果的0.40 U/g上升至1.04 U/g，鮮切處理可以顯著提高β-葡萄糖苷酶活性。鮮切火龍果低溫貯藏期間β-葡萄糖苷酶活性持續(xù)下降，在第7 天降至最低值（0.11 U/g）。

圖5 鮮切火龍果在低溫貯藏過程β-葡萄糖苷酶活性變化Fig. 5 Changes of β-glucosidase activity in fresh-cut pitaya during cold storage

鮮切水果的生理生化變化與完整組織不同，切割后的果蔬細胞受損而且沒有表皮的保護，乙烯釋放量的增加和酚類、黃酮類、萜類、生物堿等次生代謝物質的生成，是植物組織損傷后的生命活動[19]。火龍果細膩多汁，采后生理代謝旺盛，果實的可溶性固形物和可滴定酸含量直接影響火龍果的品質。本研究表明，鮮切處理對可溶性固形物和可滴定酸含量無不利影響?？扇苄怨绦挝镌诨瘕埞r切后含量顯著上升，后續(xù)貯藏期間含量變化不大?？扇苄蕴鞘怯绊懟瘕埞L味品質的重要因素，在很大程度上，火龍果果實品質取決于果實所含糖的種類和數(shù)量[20]。 火龍果中幾乎不含蔗糖，葡萄糖和果糖是主要的可溶性糖。鮮切火龍果低溫貯藏前期可溶性糖含量顯著上升，后期由于呼吸消耗等可溶性糖含量下降。

目前對鮮切水果的研究主要集中在保持或提高鮮切產品的外觀品質（如色澤、質地），減少產品腐爛以及生理方面。揮發(fā)性風味物質是影響水果風味的關鍵因素，但是在火龍果中研究較少。Célis等[21]從黃皮火龍果中鑒定出121 種游離態(tài)香氣物質，包括萜烯、醇、醛、酯、酸、酮和其他一些化合物，其中醛類物質是檢測到含量最豐富的揮發(fā)性物質，與本研究結果一致。黃皮火龍果較其他火龍果小，味道清香回甘，甜度也是其他火龍果中最高的[22]，而且糖分含量的高低是影響黃皮和紅皮火龍果香氣種類差異的因素之一。Obenland等[10]研究3 種紅心火龍果在不同貯藏溫度下香氣物質的變化，共檢測到34 種揮發(fā)性物質，其中己醛是火龍果中book=149,ebook=167最豐富的化合物，占該類化合物總量的92%。本研究中正己醛是火龍果最主要的揮發(fā)性物質，占醛類物質的78%～87%，與上述研究結果一致。內酯類物質是水果中重要的揮發(fā)性物質，能夠賦予果實濃郁的果香味，內酯類物質在桃[23]、菠蘿[24]等很多水果中都能檢測到，但是火龍果中不含內酯類香氣物質?；瘕埞休葡╊愇镔|含量僅次于醛類物質，火龍果鮮切后與全果相比含量顯著上升，可能是結合態(tài)形式的萜烯類物質被部分酶解釋放出來。Ceccarelli等[25]研究了鮮切油桃與全果在低溫貯藏期間香氣的變化，研究發(fā)現(xiàn)鮮切油桃在貯藏過程中產生更多的乙醛、丁醛和己醛等醛類物質。作為對機械損傷的典型反應，C6醛的增加通常與組織破壞有關，此外，C6醛是信號網絡的一部分，可導致由植物組織中的機械損傷觸發(fā)的植物防御系統(tǒng)的激活[26-27]。在本研究中，火龍果鮮切后也出現(xiàn)相同的情況，其中2-己烯醛、正己醛和2,4-己二烯醛這3 種C6醛含量顯著上升，可能也是火龍果對組織發(fā)生損傷的反應，使更多醛類香氣物質釋放出來?；瘕埞r切后造成的組織破壞也增加了其他幾種酯類物質的釋放，其中辛酸甲酯、己酸甲酯和癸酸甲酯等含量顯著上升。

結合態(tài)香氣物質是果實重要的潛在香氣來源，在酶解或酸解的作用下釋放出來，起到增香的作用。本研究中檢測到火龍果中結合態(tài)香氣物質17 種，且游離態(tài)和結合態(tài)香氣物質含量和種類差異較大，只檢測到苯乙醛和3-辛酮2 種共有物質，結合態(tài)形式苯乙醛和3-辛酮含量分別高出游離態(tài)形式的4 倍和1 倍左右。其中游離態(tài)和結合態(tài)3-辛酮在鮮切火龍果貯藏期間呈現(xiàn)相反的變化趨勢，火龍果在鮮切1 h后隨著β-葡萄糖苷酶活性顯著上升，結合態(tài)3-辛酮含量下降，游離態(tài)形式含量上升。游離態(tài)和結合態(tài)苯乙醛在鮮切火龍果貯藏1 h后也呈現(xiàn)相反變化趨勢，直至第7天兩者含量都略有上升。萜烯類物質易與糖類物質結合形成以糖苷形式存在的物質，反式-芳樟醇氧化物、橙花醛和檸檬醛是檢測到的 3 種重要的萜烯類物質，在鮮切火龍果貯藏過程中呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢?；瘕埞r切后，隨著組織的破裂，β-葡萄糖苷酶與貯存在果實液泡中的結合態(tài)醇類和酮類物質接觸，使結合態(tài)醇類和酮類物質含量顯著下降。結合態(tài)醛類和酯類含量均在貯藏1 d后達到最高值，第3天含量顯著下降?；瘕埞杏坞x態(tài)和結合態(tài)香氣物質在種類上差異很大，且結合態(tài)香氣物質含量都普遍較低，火龍果中含量較高的（＋）-α-長葉蒎烯、長葉稀、正己醛和2-己烯醛等揮發(fā)性物質均未以結合態(tài)形式存在。2 種形式香氣物質種類差異較大的情況還在荔枝[28]、刺梨[29]和橙子[30]等 果實中出現(xiàn)。Garcia等[17]研究了不同品種獼猴桃果實中的結合態(tài)香氣物質，結果顯示獼猴桃果實中結合態(tài)香氣物質與獼猴桃中特征香氣物質有很大差異，作者認為以結合態(tài)形式存在的香氣物質可能不是獼猴桃風味的主要貢獻者，而是潛在風味的來源。β-葡萄糖苷酶可以催化香氣物質由結合態(tài)向游離態(tài)形式的轉變，本研究中，鮮切處理后β-葡萄糖苷酶顯著上升，從而結合態(tài)醇類和酮類物質含量顯著下降。

結合態(tài)香氣物質由糖苷配基與糖類物質結合形成，糖類物質在結合態(tài)香氣物質形成中起關鍵作用。目前對香氣物質與糖之間的研究結果也不統(tǒng)一。Hellín等[31]研究了葡萄中萜烯類香氣糖苷含量與果實成熟度的關系，結果表明隨著葡萄果實的成熟，果實含糖量逐漸上升，大多數(shù)萜烯類香氣糖苷的含量比較穩(wěn)定，只有少數(shù)隨之上升，有些萜烯類糖苷含量呈現(xiàn)下降趨勢。本研究中，隨著鮮切火龍果中葡萄糖含量的上升，結合態(tài)香氣物質含量也增加；后期隨著葡萄糖含量的下降，結合態(tài)香氣物質含量呈現(xiàn)先下降后保持穩(wěn)定的趨勢。

綜上，火龍果在鮮切后可溶性固形物、可溶性糖和游離態(tài)香氣物質含量顯著上升，低溫貯藏期間呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。結合態(tài)醇類和酮類物質含量在鮮切后顯著下降，結合態(tài)形式的萜類物質含量上升，總結合態(tài)香氣物質含量在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。