穩(wěn)定同位素內(nèi)標GC-QqQ-MS/MS法測定葡萄中33 種農(nóng)藥殘留及其污染特征分析

鐘浩文，楊國順，陳文婷，白 描，譚 君

（湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南 長沙 410128）

葡萄在全球食品消費中占據(jù)著非常重要的市場地位[1]。據(jù)統(tǒng)計，2014年全球葡萄產(chǎn)量估計為7 370萬 t，其中歐洲占41%，亞洲占29%，美洲占21%[1-2]。在葡萄的生產(chǎn)過程中，農(nóng)藥被廣泛應用于控制和防治病蟲害，以增加作物產(chǎn)量；尤其是葡萄園中最常見的真菌病害，如白粉病、霜霉病和灰霉病等[3]。某些情況下，在葡萄園中如果農(nóng)藥施用不規(guī)范，將會造成葡萄果實內(nèi)或果皮上的農(nóng)藥殘留超標[4]。除了較大的環(huán)境風險之外，高濃度的農(nóng)藥殘留會影響葡萄及其加工制品的品質(zhì)，并最終造成對消費者的健康危害。因此，監(jiān)測并控制葡萄中的農(nóng)藥殘留勢在必行。

當前國內(nèi)外有關食品中農(nóng)藥最大殘留限量（maximum residue levels，MRLs）的法規(guī)中[5-6]，明確規(guī)定了葡萄果實中的農(nóng)藥殘留允許標準，不同農(nóng)藥物質(zhì)的MRLs值在0.01～5.00 mg/kg之間[2,5]。目前應用于食品中農(nóng)藥殘留檢測的經(jīng)典儀器方法為氣相色譜法和液相色譜法[7-8]，但其對于不同類型農(nóng)藥的同時分析能力較弱；而質(zhì)譜方法由于具有選擇性強、靈敏度高的特點，被廣泛應用于構建同時分析不同類型農(nóng)藥的多殘留檢測方法[9-12]。各項國際法規(guī)標準也推薦使用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用或液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用的方法，檢測葡萄中的農(nóng)藥殘留量[13-14]。2007年美國分析化學家協(xié)會的官方推薦儀器檢測方法[15]，同樣為GC-MS或LC-MS方法。

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（triple quadrupole tandem mass spectrometry，QqQ-MS/MS）法作為一種升級的質(zhì)譜檢測方法受到廣泛關注。QqQ-MS/MS采用選擇性的多反應監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）數(shù)據(jù)采集模式，通過降低色譜的化學噪音，減小甚至消除基質(zhì)干擾，可大大降低方法的檢出限（limits of detection，LOD）[2,11,16-24]。但是在實際應用中，由于葡萄生產(chǎn)中所施用的農(nóng)藥多為小分子化合物，在電子電離（electron ionization，EI）的方式下，很難找到滿足QqQ-MS/MS要求的合適離子對，或者離子對豐度較低，或者離子對數(shù)量較少，從而影響農(nóng)藥目標物定性與定量分析的準確性[2,17,25]。

本實驗開展農(nóng)藥目標物的質(zhì)譜裂解行為研究，探索特征碎片離子的微觀化學結構及其二次質(zhì)譜碎裂的機理，挖掘合適的MS/MS分析離子對。此基礎上構建了GC-QqQ-MS/MS MRM的穩(wěn)定同位素內(nèi)標定量分析方法，有效降低基線噪音、增強分析靈敏度（LOD較之前文獻報道的GC-MS方法[9-10,12,14-15]低1～2 個數(shù)量級）、避免出現(xiàn)假陽性結果。以穩(wěn)定同位素全氘標記物作為定量的內(nèi)標物質(zhì)，以期有效避免樣本基質(zhì)中可能存在內(nèi)標物質(zhì)干擾峰，造成定量計算結果偏差較大的風險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄樣品由湖南省各地區(qū)的葡萄種植戶（葡萄園）提供，包括夏黑和陽光玫瑰2 個市場主流品種。

正己烷（農(nóng)藥殘留級）、甲醇（色譜級）、乙腈（色譜級）、二氯甲烷（色譜級） 百靈威科技有限公司進口分裝；甲苯（分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；丙酮（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Cleanert S C18萃取小柱（2 g/12 mL）、Cleanert NH2氨基萃取小柱（500 mg/3 mL）、Cleanert PestiCarb活性炭萃取小柱（500 mg/6 mL） 北京艾杰爾科技有限公司。

腈菌唑（98.5%）、啶酰菌胺（99%）、烯酰嗎啉（98%）、烯唑醇（99.5%）、氟硅唑（1.00 mg/mL）、腐霉利（96.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲氰菊酯（100 μg/mL）、百菌清（98%）、戊唑醇（95%）、霜霉威（99%）、嘧霉胺（100 μg/mL）、抗蚜威（100 μg/mL）、撲海因（100 μg/mL）、唑菌胺酯（100 μg/mL）、腈嘧菊酯（100 μg/mL）、丙森鋅（100 μg/mL）、氟蟲腈（98%）、抑霉唑（97%）、氟氰戊菊酯（1 000 mg/L）、苯醚甲環(huán)唑（98%）、戊菌唑（95%）、毒死蜱（99%）、噻嗪酮（99%）、三氟氯氰菊酯（98%）、噠螨靈（99%） 美國AccuStandard?Inc.公司；S-氰戊菊酯（99%）、溴氰菊酯（99.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；殺蟲環(huán)（100 μg/mL）、久效磷（100 μg/mL）、乙拌磷（100 μg/mL）、對硫磷（100 μg/mL） 農(nóng)業(yè)部環(huán)境與保護監(jiān)測所；全氘代間三聯(lián)苯（p-terphenyl-D14，TPh-D14，98%） 美國Cambridge Isotope Laboratories Inc.公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備7693自動進樣器） 美國Agilent公司；XW-80A旋渦混合器江蘇海門其林貝兒儀器有限公司；H-2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FJ-200均質(zhì)器上海標模有限公司；HSE-12B固相萃取儀 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；XD-200A旋轉蒸發(fā)儀 上海賢德實驗儀器有限公司；NDK200-1氮吹儀 杭州米歐儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；MS105型電子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

33 種農(nóng)藥標準品中，將純品直接溶解于二氯甲烷配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一標準儲存溶液；液體溶液直接裝入儲存瓶中。移取適量的上述溶液于同一個容量瓶中，以二氯甲烷溶劑稀釋定容，配制成質(zhì)量濃度為0.001 6、0.008 0、0.020 0、0.040 0、0.080 0、0.160 0、0.200 0 mg/L和0.320 0 mg/L的混合標準使用溶液，所有上述標準溶液于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

參考文獻[26]的方法，將葡萄果實樣品切碎、混勻、攪碎，準確稱取10.00 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取1 min，加入2.5 g NaCl，再勻漿提取1 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，待凈化。

將上述10 mL提取液轉入用10 mL乙腈淋洗過的C18萃取小柱（2 g/12 mL），以15 mL乙腈洗脫，收集流出液真空濃縮至約1 mL，備用。在NH2氨基萃取小柱的頂部，串聯(lián)PesticiCarb活性炭萃取小柱（預填約2 cm高的無水Na2SO4），以4 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）混合溶液淋洗后，將前述濃縮液徹底轉移至NH2氨基萃取小柱，用25 mL乙腈-甲苯混合溶液（3∶1，V/V）洗脫，收集所有流出物于50 mL離心管中，真空濃縮至約0.5 mL，以正己烷進行溶劑置換后，加入5.00 μL質(zhì)量濃度為1.00 mg/L的TPh-D14內(nèi)標溶液，渦旋混勻，待GC-QqQ-MS/MS MRM分析。

1.3.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent HP-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持1 min，最后以2 ℃/min升溫至290 ℃保持0 min；進樣口溫度280 ℃；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：EI源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式：1）全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z45～600；2）MRM。

2 結果與分析

2.1 QqQ-MS/MS MRM分析方法的建立

首先在EI離子化方式下，采用全掃描模式對農(nóng)藥目標物的混合標準溶液實現(xiàn)基線分離，確定各目標物出峰的保留時間見表1。參考文獻[19-20]方法，調(diào)用美國國家標準與技術研究院質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中所有目標物的標準質(zhì)譜圖，結合全掃描標準溶液的實際質(zhì)譜圖，挑選各目標物的前級母離子進行二次質(zhì)譜裂解（表1）。再后，在遵循特征子離子挑選原則的基礎上（盡量選擇豐度較高，且保留對應化合物的特征基團結構），通過子離子掃描模式建立定性離子對與定量離子對（表1）。最后，進行各離子對的碰撞能量優(yōu)化實驗，確定其最佳豐度情況下所對應的碰撞能量值，從而建立最優(yōu)化的GC-QqQ-MS/MS MRM分析方法。經(jīng)實驗證實，該方法基線噪音小、干擾少、信噪比高，對于農(nóng)藥殘留檢測的選擇性好且靈敏度高。

表1 農(nóng)藥目標物的基本理化學信息和鑒定特征Table 1 Chemical information about target pesticide compounds and MS/MS parameters for them

2.2 內(nèi)標物質(zhì)的選擇

內(nèi)標定量方法能夠有效解決不同樣品基質(zhì)對目標物響應的抑制或增強作用，提高定量的準確性[20]。采用內(nèi)標法繪制的工作曲線，較外標工作曲線方法呈現(xiàn)更好的線性相關，其線性相關系數(shù)值更高。而本實驗方法所采用的穩(wěn)定同位素內(nèi)標物質(zhì)，相對于食品安全國家標準方法[26]中推薦的環(huán)氧七氯內(nèi)標物質(zhì)，能夠更有效地避免由于樣品中本身存在此類物質(zhì)而造成定量結果偏低的問題，故本實驗中以TPh-D14作為定量計算的穩(wěn)定同位素內(nèi)標物。

2.3 目標物的質(zhì)譜裂解行為分析

建立MS/MS方法需要挑選具有較強特征性結構的前級母離子，即m/z較大且保留較完整官能團結構的碎片離子，以便于在進一步的二級質(zhì)譜裂解過程中，挖掘具有特征性結構的碎片離子（子離子），構建目標物專屬的強選擇性的定性與定量離子對。然而，葡萄生產(chǎn)中所涉及的農(nóng)藥目標物，除了擬除蟲菊酯類之外，絕大多數(shù)為小分子化合物（相對分子質(zhì)量小于350）[2,17,25]，在EI方式下，很難保留其對應的分子離子等質(zhì)量數(shù)較大（m/z較大）的碎片離子，造成二級質(zhì)譜裂解離子對的選擇困難。

本實驗重點對二級質(zhì)譜裂解中的子離子與母離子的碎裂機理進行解析，對特征碎片離子的結構歸屬進行探索，尋求適合MS/MS準確定性與定量分析的合適的離子對，為農(nóng)藥化合物的質(zhì)譜裂解行為研究（尤其是二級質(zhì)譜乃至多級質(zhì)譜裂解）奠定基礎。以氟蟲腈和咪鮮胺為例，如表1所示，氟蟲腈的二級質(zhì)譜裂解前級母離子為m/z367的碎片離子，該母離子由其圖1a中的分子離子（m/z437.14）進行一級質(zhì)譜裂解所得，進行二級質(zhì)譜裂解則分別得到子離子m/z180、124，分別構建m/z367＞180的離子對作為定量計算；m/z367＞124的離子對作為輔助定性。同樣如圖1b所示，咪鮮胺的定性與定量分析離子對分別為m/z308的一級質(zhì)譜碎片離子（母離子）進行二級裂解所得子離子m/z70和m/z85。

圖1 氟蟲腈（a）和咪鮮胺（b）的MS/MS碎片離子結構與二級質(zhì)譜裂解機理Fig.1 Structures of MS/MS fragment ions from fipronil (a) and prochloraz (b) and mechanisms for their secondary mass spectrometric fragmentation

2.4 質(zhì)量控制與方法學驗證

2.4.1 全過程空白

將等體積的超純水同1.3.2節(jié)進行樣品前處理，平行3 次，經(jīng)GC-MS/MS檢測證實，如表2所示，在所有目標物出峰的時間段，不存在試劑空白的出峰干擾，該方法具有較強的專屬性，從而空白干擾少且定性準確。

表2 農(nóng)藥目標物的方法空白、方法線性與范圍、儀器LOD、方法LOQ、加標回收率、RSD和國標規(guī)定MRLsTable 2 Calibration curve correlation coefficients, LOD, LOQ,recoveries and RSD for target pesticide compounds and maximum residue limits stipulated for them by Chinese national standard

2.4.2 線性與范圍

參考國標[6]對農(nóng)藥目標物在食品中最大殘留限量的相關規(guī)定，重復3 次檢測如上1.3.1節(jié)較寬質(zhì)量濃度范圍的混合標準使用溶液。由表2可見，在0.001 6～0.320 0 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，該方法呈現(xiàn)良好的線性相關，其線性相關系數(shù)（R）不低于0.994 7。

2.4.3 方法靈敏度

依據(jù)國際純化學和應用化學聯(lián)合會對于LOD的定義，分別采用3 倍和10 倍信噪比計算儀器LOD和方法定量限（limit of quantification，LOQ），結果見表2。該方法的LOD和LOQ分別為0.064～40.000 μg/L和0.000 02～0.013 33 mg/kg，符合歐盟、美國、日本和中國等組織對于食品中農(nóng)藥殘留分析的方法靈敏度要求。此外，食品安全國家標準方法[26]采用選擇離子監(jiān)測法，對葡萄中的上述農(nóng)藥進行定性與定量測定，其LOQ為0.012 6～0.300 0 mg/kg，而本方法采用QqQ-MS/MS方法，具有更低的LOQ，方法靈敏度更高、干擾少，且定性更可靠。

2.4.4 方法準確性

通過在葡萄樣品中添加農(nóng)藥目標物的回收率實驗驗證該方法的準確性。如表2所示，高、中、低3 個不同添加水平（0.10、0.50 mg/kg和1.00 mg/kg），每個添加水平重復3 次，同樣進行樣品前處理后，經(jīng)GC-MS/MS MRM檢測，分析各目標物的加標回收率。

表2證實，當加標量較低時（0.10 mg/kg）回收率在70.1%～94.7%之間；當加標量居中時（0.50 mg/kg）回收率在72.1%～109.8%之間；當加標量較高時（1.00 mg/kg）回收率在71.6%～120.6%之間。該方法的準確度較高，3 種不同添加水平的回收率結果均在70.1%～120.6%之間，且目標物的加標量越多回收率越高。目標物的損失均在可以接受的范圍之內(nèi)，符合食品安全國家標準方法中[26]，對于水果和蔬菜中農(nóng)藥測定的回收率結果要求。

2.4.5 方法重復性

計算不同添加水平葡萄樣品的回收率結果之間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以此統(tǒng)計該方法的精密度，并對其實驗室內(nèi)重復性進行有效估計。由表2可見，該方法的加標回收率結果之間的RSD在3.3%～17.9%的范圍內(nèi)，符合食品安全國家標準方法中[26]，對于水果和蔬菜中農(nóng)藥測定的實驗室內(nèi)重復性要求（精密度＜18%）。

2.5 葡萄樣品中的農(nóng)藥殘留量分析

2.5.1 不同樣品的農(nóng)藥污染水平

將所建立的方法應用于湖南地區(qū)不同葡萄園中的不同品種葡萄樣品分析，20 份葡萄樣品中有15 份樣品檢出農(nóng)藥；而有檢出的農(nóng)藥目標物為17 種，且殘留總量最高達2 451.8 μg/kg；但所有檢出的各項農(nóng)藥目標物的殘留量均未超過我國的最大殘留限量規(guī)定[6]。檢出的農(nóng)藥中殘留量最大的為撲海因、腈嘧菊酯和烯酰嗎啉，總檢出量分別為1 965.5、385.0 μg/kg和1 152.5 μg/kg；同時圖2中的統(tǒng)計結果證實，這3 種農(nóng)藥的施用與當?shù)仄咸褬悠分械霓r(nóng)藥殘留問題呈明顯正相關，應成為需要重點關注和嚴格控制的葡萄園農(nóng)用藥品。

圖2 不同采樣點葡萄樣品中的關鍵性污染農(nóng)藥Fig.2 The key contamination pesticides in grape samples at different sampling points

2.5.2 不同樣品的農(nóng)藥殘留分布規(guī)律

在葡萄園生產(chǎn)過程中較常使用的農(nóng)藥，在各地的葡萄樣品中均有檢出（圖3），如防治灰霉病的嘧霉胺、腐霉利和撲海因；用于浸果保鮮的抑霉唑；防殺蚧殼蟲的噻嗪酮；防治白腐病的戊唑醇；防治霜霉病的腈嘧菊酯和烯酰嗎啉等，可見葡萄園的農(nóng)藥施用情況直接影響到葡萄果實中相關農(nóng)藥的殘留情況。且由圖3可見，各種農(nóng)藥目標物在不同葡萄樣品中的分布差異較大，尤其是撲海因、嘧霉胺、腈嘧菊酯和烯酰嗎啉的樣品分布差異顯著。在西部地區(qū)的葡萄樣品中，這4 種農(nóng)藥的檢出量較多，充分說明該地區(qū)葡萄園中使用防治灰霉病或霜霉病的藥物較多，根本原因在于葡萄園的病害發(fā)生概率高還是農(nóng)民濫用農(nóng)藥所造成的，仍有待后續(xù)研究進一步考證。

圖3 各農(nóng)藥目標物在葡萄樣品中的分布情況箱形圖Fig.3 Distribution of all target pesticides in grape samples

2.5.3 不同采樣區(qū)域的污染與分布特征

本實驗中葡萄樣品來源于湖南省東、南、西、北、中5 個區(qū)域，以當?shù)氐闹饕咸褕@作為采樣點，首先將每個葡萄樣品中檢測到的目標農(nóng)藥濃度歸一化為其總濃度，然后對歸一化數(shù)據(jù)集進行偏最小二乘判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）[27-30]。在各采樣區(qū)域的PLS-DA評分圖（圖4）中，來自相同區(qū)域的葡萄樣品可聚為一塊，具有極為類似的農(nóng)藥分布情況。

圖45 個區(qū)域葡萄果實樣品中農(nóng)藥殘留的PLS-DA評分圖Fig.4 Score plots of PLS-DA for pesticide residues in grape samples collected from five major sampling sites in Hunan province

湘東區(qū)域的葡萄樣品僅有一個檢出有甲氰菊酯（4.43 μg/kg）和腈嘧菊酯（5.00 μg/kg），其他樣品均未檢出（低于方法LOQ）；其他不同區(qū)域的葡萄樣品均有不同種類的農(nóng)藥殘留檢出，尤其是湘西地區(qū)葡萄樣品中農(nóng)藥殘留量較高且品種較多。同時，由于撲海因的檢出量較高，湘南、湘西和湘中區(qū)域的葡萄樣品中的目標農(nóng)藥分布與主成分1呈正相關。在湘北區(qū)域的葡萄樣品中，腈嘧菊酯相對含量較高，目標農(nóng)藥分布與主成分1呈負相關。此外，撲海因是防治葡萄灰霉病的主要農(nóng)藥，而腈嘧菊酯為防治葡萄霜霉病的主要農(nóng)藥，由此獲得提示，在湖南省域內(nèi)葡萄的灰霉病和霜霉病為主要的病蟲害類型，需要引起廣泛關注，而本地區(qū)的葡萄園中病蟲害防治需要進行進一步的合理用藥指導。

3 結 論

本實驗建立了葡萄果實中33 種農(nóng)藥殘留同時定性定量分析的GC-QqQ-MS/MS方法，在優(yōu)化MRM模式參數(shù)條件和解析目標物二級質(zhì)譜裂解機制的基礎上，引入穩(wěn)定同位素全氘標記物（TPh-D14）作為內(nèi)標物質(zhì)，有效排除復雜基質(zhì)干擾、增強目標物響應信號、降低基線噪音，使目標物實現(xiàn)基線分離，大大提高了分析靈敏度（較國標方法高1～2 個數(shù)量級），從而獲得更加準確的定性與定量分析結果。該方法滿足國家標準方法中的所有規(guī)定指標[26]，如平行實驗、空白實驗、重復性、LOQ和回收率等，適用于葡萄果實和其他水果蔬菜等食品中痕量/超痕量的農(nóng)藥殘留分析和有效控制。