熊楓然 盧 晶 張英超 謝榮榮 趙儒軒 李 奇 楊金奎

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室 北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為臨床特征的代謝性疾病。糖尿病在中國是一個重要的健康問題，成年人中的患病率從2007年的9.7%上升到2017年的11.2%，中國的糖尿病疾病負(fù)擔(dān)在持續(xù)增加[1]。世界范圍內(nèi)，糖尿病病例數(shù)已超過4億，據(jù)估計將會在2030年達(dá)到5億[2]。糖尿病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。

本課題組[3]在前期工作中發(fā)現(xiàn)了1個KCNH6鉀通道雜合突變的糖尿病家系。KCN基因(human ether-a-go-go related gene)家族編碼的KCN通道屬于電壓門控鉀通道(voltage-gated potassium channel，Kv)中的一員，在調(diào)節(jié)人和小鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌方面起著至關(guān)重要的作用。KCN鉀通道家族有3種亞型： KCNH2、KCNH6、KCNH7，他們在Kv家族中排名 11位，因此又被稱為Kv11家族[4]。研究[5]顯示，KCNH2通道突變的患者患有2型長QT間期綜合征(long-QT syndrome)且有胰島素分泌水平升高的表現(xiàn)。但KCNH6參與胰島素分泌的具體機(jī)制及與糖尿病發(fā)病之間的關(guān)系還知之甚少。

前期研究[6]中使用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技術(shù)刪除了Kcnh6基因的19個堿基對，構(gòu)建了KCNH6基因敲除小鼠模型。為了更精確地研究KCNH6的作用，把基因突變控制在單個堿基上，完全模擬糖尿病家系中的單基因位點突變，排除大段基因編輯可能引入的混雜因素的影響。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來新興的一種基因定點編輯工具，它最初是細(xì)菌用來對抗病毒入侵的一種防御機(jī)制，包括成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及臨近相關(guān)基因(CRISPR-associated gene，Cas)。該技術(shù)已經(jīng)成功運用于細(xì)菌、水稻、小鼠、大鼠、斑馬魚等物種的基因編輯與改造[7]。小向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)是一段人工設(shè)計的RNA復(fù)合體，它可以通過堿基互補配對靶向定位到含有前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列(即NGG)的待編輯的目標(biāo)DNA片段附近[8]。Cas9蛋白是一種能與sgRNA結(jié)合的特殊的核酸內(nèi)切酶，在sgRNA的定位作用下，細(xì)胞基因組DNA雙鏈將會被Cas9精確剪切，在此基礎(chǔ)上如果為細(xì)胞引入一個攜帶靶片段同源臂和突變位點序列的模板質(zhì)粒(供體DNA)，被打斷的DNA雙鏈將會通過同源重組修復(fù)機(jī)制、按照所提供的模板在修復(fù)過程中實現(xiàn)片段插入(knock-in，KI)或定點突變[9]。

本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了Kcnh6基因定點突變小鼠，為進(jìn)一步研究糖尿病發(fā)病機(jī)制提供了動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用的小鼠均為C57BL/6J品系，體質(zhì)量18～24 g,購自南京集萃藥康生物科技有限公司，實驗動物許可證號：SYXK(蘇)2018-0027。小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級實驗動物中心，恒溫恒濕，12 h光照，12 h黑暗，自由采食。實驗所使用的所有動物均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院動物委員會批準(zhǔn)。

1.2 根據(jù)靶序列設(shè)計sgRNA及供體DNA質(zhì)粒

從NCBI小鼠基因組網(wǎng)站得到Kcnh6基因(Gene ID:192775)的序列和結(jié)構(gòu)信息。遵從CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點突變靶點設(shè)計原則，根據(jù)小鼠Kcnh6基因第5個外顯子序列進(jìn)行分析，設(shè)計得到兩段sgRNA序列(靶點序列:5′-CTGCTAGGAAGACCGGTCTATGG-3′;5′-GAAGCCATGGGTGGTCAGTGGG-3′)。根據(jù)sgRNA序列設(shè)計含有靶片段同源臂和定點突變的供體DNA質(zhì)粒，設(shè)計策略見圖1。

圖1 CRISPR/Cas9設(shè)計策略Fig.1 Design strategy of CRISPR/Cas9

1.3 小鼠基因型的鑒定

剪取小鼠尾尖0.5 cm置于1.5 mL的EP管內(nèi)，加入400 μL裂解液和1 μL蛋白酶K儲存液，將上述EP管置于55 ℃恒溫水浴鍋水浴過夜，待消化完全，使用酚/氯仿法抽提基因組DNA。下列反應(yīng)物構(gòu)成20 μL的反應(yīng)體系：模板DNA 2.0 μL，10×緩沖液 (含Mg2+) 2.0 μL，dNTP 混合物(10 mmol/L) 0.5 μL，引物混合物(10 mol/L) 0.5 μL，DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，超純水14.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s；退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s；共40個循環(huán)，最后再延伸70 ℃ 10 min，之后25 ℃保存。PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。制備2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠，取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物5 μL進(jìn)行電泳，135 V，20 min。電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳圖片分析。為進(jìn)一步驗證，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測序(測序由諾賽基因公司完成)。

1.4 顯微操作和F0代鑒定

將上述sgRNA、Cas9及供體DNA質(zhì)粒共同注射入小鼠受精卵胞質(zhì)，存活受精卵移植入假孕小鼠子宮，經(jīng)發(fā)育、分娩得到F0代小鼠。取小鼠尾尖進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用初篩引物篩選出突變基因插入的樣品，排除未插入的陰性樣品。選擇其中的雄性陽性小鼠樣品進(jìn)行測序確認(rèn)。

初篩引物:Nicemice-TF: 5′-AACATCTGCGAGATGATTTGTGAG-3′; Kcnh6-Donor-5′out-tR1: 5′-GTGGTTCGGAAGTTGATGAC-3′。

1.5 繁育純合突變小鼠

將含KI片段的雄性F0代小鼠與野生型C57BL/6J雌性小鼠進(jìn)行繁育，得到F1代小鼠。經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序篩選出F1 代雜合子，然后以基因型為雜合子的F1代小鼠作為親本，交配繁育得到F2代小鼠，再對F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，篩選出純合基因KI小鼠，從而完成純合突變?nèi)后w的建立。

引物：Kcnh6-Donor-5′in-tF1:5′-CATCAGATATCCTGCATGTC-3′;Nicemice-TR:5′-CTCACAAATCAT- CTCGCAGATGTT-3′;Nicemice-TF:5′-AACATCTGCG- AGATGATTTGTGAG-3′;Kcnh6-Donor-3′in-tR1:5′-CTATGGCCCATATGGAAATC-3′。

1.6 小鼠分組

根據(jù)喂養(yǎng)飼料不同，將繁育鑒定完成的純合小鼠分為兩組：普飼組以普通飼料喂養(yǎng)，高脂組以高脂飼料喂養(yǎng)。每組內(nèi)再根據(jù)小鼠基因型不同分為兩組：點突變組和野生型組。分別在小鼠4、8、12周測量小鼠體質(zhì)量。

1.7 小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗(intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT)及第一時相胰島素濃度測定

小鼠禁食12～14 h后，腹腔注射20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖溶液，注射體積為小鼠體質(zhì)量(g)×10 μL，用固定器固定小鼠，分別測定葡萄糖負(fù)荷后0、15、30、60和120 min時小鼠尾靜脈血糖濃度。血糖測定用美國強(qiáng)生公司One-Touch血糖儀及配套試紙。

小鼠禁食12～14 h后，腹腔注射20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖溶液，注射體積為小鼠體質(zhì)量(g)×10 μL，于0、2、5、15、30 min自眼眶靜脈叢采血。4 ℃，3 000 r/min 離心10 min后，收集血清。采用小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國Millipore公司)測定血清胰島素濃度。

1.8 小鼠原代胰島細(xì)胞提取及純化

頸椎脫臼法處死小鼠后，將小鼠置于無菌手術(shù)臺并用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒。打開腹腔并暴露膽總管，左手持彎鑷夾閉膽總管，右手持注射器沿膽總管逆行注射約3 mL膠原酶P消化液(1 mg/mL)。待胰腺充分膨脹后，摘除胰腺組織置于含4 ℃預(yù)冷膠原酶P消化液的15 mL離心管中。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱消化10 min至呈泥沙樣，立即向離心管加入10 mL預(yù)冷的終止液[90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HBSS+10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS]終止消化，4 ℃，300 g離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。棄上清后，依次緩慢加入2 mL 25%，1 mL 23%，1 mL 21%和1 mL 13%的Ficoll溶液，4 ℃，2 500 g 離心20 min。吸取13%～21%Ficoll層面細(xì)胞沉淀物，加溶液重懸，4 ℃1 000 g離心5 min洗滌2次。將離心后產(chǎn)物加入含有10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清的1640培養(yǎng)基，并保持在37 ℃孵箱[95%(體積分?jǐn)?shù))O2/5%(體積分?jǐn)?shù))CO2]培養(yǎng)。

1.9 葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose stimulated insulin secretion，GSIS)

12孔板中，每孔15個胰島，加入含有2.8 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer, KRBB)平衡30 min，吸去平衡液，加入含有2.8 mmol/L葡萄糖的KRBB溶液，37 ℃孵育1 h，吸取上清，每孔分別加入含有16.7 mmol/L葡萄糖的KRBB溶液，37 ℃孵育1 h，吸取上清。采用小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國Milipore公司)測定上清液中胰島素濃度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Kcnh6基因敲入點突變小鼠模型

將sgRNA、Cas9 mRNA、供體DNA質(zhì)粒的混合物通過顯微注射注入小鼠受精卵胞質(zhì)中，將受精卵移植入假孕小鼠子宮，經(jīng)發(fā)育、分娩得到124只F0代小鼠。對這124只小鼠進(jìn)行DNA提取，用初篩引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，篩選出45只突變基因插入的樣品，排除其他未插入的陰性樣品(圖2)。再對初篩陽性樣品中15只雄性小鼠樣品進(jìn)行測序確認(rèn)，得到10只基因KI點突變陽性F0代小鼠，測序結(jié)果見圖3。

圖2 F0代小鼠插入序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic pattern of inserted sequence polymerase chain reaction(PCR) amplification product from F0 generation mice

圖3 F0代小鼠基因測序Fig.3 Gene sequence of F0 generation mices Arrow represent the specific mutant site.

10只KI陽性F0小鼠與野生型雌鼠交配得到F1，經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序鑒定得到KI陽性F1代雜合子小鼠(圖4)。F1與F1交配繁育得到F2，鑒定出純合基因敲入(KI)點突變純合小鼠(圖5)和純合野生型小鼠，用于后續(xù)實驗。

圖4 F1代雜合子小鼠基因測序Fig.4 Gene sequence of F1 heterozygous mices Arrow represent the specific mutant site.

圖5 F2代純合子小鼠基因測序Fig.5 Gene sequence of F2 homozygous mices Arrow represent the specific mutant site.

2.2 Kcnh6基因敲入點突變小鼠與C57BL/6J野生型小鼠體質(zhì)量監(jiān)測

兩組小鼠體質(zhì)量均隨喂養(yǎng)時間均穩(wěn)定增長,普飼組中點突變組和野生型組小鼠體質(zhì)量未見明顯區(qū)別，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高脂組中點突變組小鼠體質(zhì)量在第4周時比野生型小鼠低，在第8周、第10周超過野生型小鼠，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖6 體質(zhì)量監(jiān)測Fig.6 Weight monitoring A: standard diet； B： high fat diet； n=6, *P<0.05 vs WT group; WT: wildtype; Kcnh6-KI： Kcnh6 knock-in.

2.3 Kcnh6基因敲入點突變小鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)后糖耐量和胰島素分泌功能受損

分別對高脂飼養(yǎng)的24周齡的Kcnh6基因插入點突變(KI)小鼠和野生型(WT)小鼠進(jìn)行IPGTT實驗，Kcnh6 KI小鼠血糖水平在糖負(fù)荷后15、30、60、120 min均高于野生型小鼠，且在60 min時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但同周齡普通飼的Kcnh6基因插入點突變(KI)小鼠和野生型(WT)小鼠IPGTT比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。

圖7 腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量實驗 Fig. 7 Intra-peritoneal glucose tolerance test A: high-fat diet; B: normal chow diet； n=8，*P<0.05 vs WT group; WT: wildtype; Kcnh6-KI: Kcnh6 knock-in.

分別測量高脂飼養(yǎng)的28周齡Kcnh6 KI小鼠與WT小鼠的第一時相胰島素分泌水平。Kcnh6 KI小鼠在糖負(fù)荷后2 min和5 min的胰島素分泌水平明顯低于WT小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。為進(jìn)一步研究Kcnh6點突變對胰島功能的影響，在體外對小鼠原代胰島做了葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗，Kcnh6 基因點突變抑制了小鼠胰島在高糖刺激下的胰島素分泌，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖8)。

圖8 胰島素分泌功能Fig. 8 Insulin secretion functionA: the first phase of insulin secretion(n=6); B: glucose stimulated insulin secretion test(n=6)； *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001 vs Kcnh6-KI group; WT: wild type; Kcnh6-KI: Kcnh6 knock-in, KI: knock in.

3 討論

胰島素生物作用的絕對或相對不足是糖尿病代謝紊亂的中心環(huán)節(jié)。胰島素分泌受多種因素調(diào)節(jié)，其中血糖是調(diào)節(jié)胰島素分泌最重要的因素。以ATP敏感鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)為開關(guān)的葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose stimulated insulin secretion,GSIS)的具體機(jī)制已較為清楚：進(jìn)入胰島β細(xì)胞的葡萄糖與血糖水平成正比，進(jìn)入細(xì)胞后葡萄糖經(jīng)一系列氧化過程在線粒體產(chǎn)生ATP，使ATP/ADP比例增加[10]，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞膜ATP敏感鉀通道(KATP)關(guān)閉[11]，使細(xì)胞膜去極化，激活電壓門控L型鈣通道，導(dǎo)鈣離子內(nèi)流增加，觸發(fā)胰島素釋放[12-13]。

本課題組[3]在前期工作中發(fā)現(xiàn)了1個KCNH6鉀通道雜合突變的糖尿病家系，家系中新生兒表現(xiàn)為低血糖癥和高胰島素血癥，成年人均表現(xiàn)為糖尿病或糖耐量異常。KCNH6鉀通道屬于Kv，研究[14]顯示，電壓門控鉀通道能影響葡萄糖刺激的胰島素分泌過程。課題組前期采用TALEN技術(shù)成功構(gòu)建了Kcnh6基因全身性敲除(global knock out)小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠存在糖耐量異常[6]，驗證了除ATP敏感鉀通道(KATP)以外，Kv同樣參與了胰島素分泌的調(diào)控，且發(fā)揮著重要作用。前期構(gòu)建基因敲除小鼠所使用的TALEN技術(shù)刪除了Kcnh6基因的19個堿基對，造成移碼突變，從而使基因喪失原有功能。而與基因大段敲除不同，本研究所采用的KI方法可以精確控制單個堿基對的突變，能完全復(fù)制出現(xiàn)在人類糖尿病家系中的Kcnh6基因點突變，排除了大段基因編輯可能引入的混雜因素的影響。

所以為了更精確地研究Kcnh6參與糖尿病發(fā)病的具體機(jī)制，在本研究中利用CRISPR/Cas9技術(shù)，經(jīng)過反復(fù)篩選、繁育最終獲得了純合Kcnh6基因KI點突變小鼠。對成功構(gòu)建的小鼠模型做了一系列初步實驗，包括體質(zhì)量監(jiān)測、腹腔葡萄糖耐量實驗(intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT)、第一時相胰島素濃度測定和葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(glucose stimulated insulin secretion，GSIS)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Kcnh6 KI小鼠在普通飼料喂養(yǎng)條件下，體質(zhì)量、糖耐量與野生型小鼠相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在高脂飼料喂養(yǎng)的誘導(dǎo)下，Kcnh6 KI小鼠出現(xiàn)了體質(zhì)量增高、糖耐量及胰島素分泌受損的表現(xiàn)，成功復(fù)制了人類糖尿病的臨床表型。

本次研究證實了Kcnh6基因在胰島素分泌和糖尿病發(fā)病過程中的重要作用，但還未具體探究Kcnh6發(fā)揮作用的具體機(jī)制。Kcnh6基因P235L位點點突變是否影響了鉀離子通道的通道功能、是否影響了鉀通道蛋白的亞細(xì)胞定位還不得而知，后續(xù)可以利用膜片鉗、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)進(jìn)一步驗證和探究。本次研究所構(gòu)建出的Kcnh6基因KI點突變小鼠模型可繼續(xù)用于往后研究，為深入揭示Kcnh6基因在胰島素分泌中的具體機(jī)制提供新的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果。