陳建宏 林 欣 馮金秋 丁鵬鵬 王苗苗 林 琳 劉 紅* 吳 靜

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100038； 2.北京大學(xué)人類疾病基因研究中心，北京 100083； 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科 國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 北京市消化疾病中心 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

細(xì)胞自噬是進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行降解和再循環(huán)的重要過(guò)程，是一種基本的細(xì)胞應(yīng)激調(diào)控機(jī)制[1]。自噬調(diào)控的異常參與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、肝臟疾病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、感染及自身免疫疾病等的發(fā)生、發(fā)展[2]。細(xì)胞自噬可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞損傷等，與非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。

Eva1a(eva-1 homolog A)，也稱為T(mén)mem166 (transmembrane protein 166)，是具有自噬和凋亡雙調(diào)控作用的人類新分子[5],該基因進(jìn)化保守，在人體多種正常組織呈現(xiàn)高表達(dá)，在癌癥組織中表達(dá)下調(diào)[6]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Eva1a能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。分子機(jī)制研究[8]表明，Eva1a能夠定位于自噬體膜，與自噬關(guān)鍵分子(autophagy related protein 16 like protein 1,ATG16L1)相互作用，在ATG12-ATG5/ATG16L1介導(dǎo)隔離膜延伸中發(fā)揮重要作用。小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞特異敲除Eva1a可通過(guò)抑制自噬，從而抑制神經(jīng)干細(xì)胞的自我復(fù)制及分化[9]。Eva1a在心肌細(xì)胞的特異敲除，導(dǎo)致自噬受損和凋亡增加，加重心肌纖維化及心肌重塑[10]。

Eva1a在肝臟中高表達(dá)，Lu等[11]研究證明C/EBPalpha 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬依賴于Eva1a的參與，Ren等[12]的研究顯示microRNA-125b 可以通過(guò)調(diào)控Eva1a誘導(dǎo)的自噬逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性，最近的研究[13]顯示在肝細(xì)胞中滅活Eva1a能夠加重急性肝損傷。本研究構(gòu)建了肝細(xì)胞Eva1a基因條件性敲除的小鼠模型，分析了該基因敲除對(duì)小鼠生理狀態(tài)下體質(zhì)量、肝臟外觀與組織結(jié)構(gòu)、肝指數(shù)、肝功能、糖脂代謝以及細(xì)胞自噬等表型的影響，為進(jìn)一步研究Eva1a在NAFLD等肝臟疾病發(fā)生中的作用及分子機(jī)制提供了動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 肝細(xì)胞條件性 Eva1a基因敲除小鼠的繁殖

以C57BL/6 為遺傳背景的Eva1a條件性基因敲除小鼠(Eva1aflox /+)由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所構(gòu)建，鼠肝細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶的Alb-Cre小鼠作為工具鼠，購(gòu)自上海南方模式生物科技股份有限公司。

將Eva1aflox /+小鼠與Alb-Cre小鼠雜交，選取后代為Eva1aflox /+:Alb-Cre基因型的小鼠。Eva1aflox /+:Alb-Cre小鼠之間交配，選取后代為Eva1aflox/flox和Eva1aflox/flox:Alb-Cre基因型的小鼠。后續(xù)繁殖均為Eva1aflox/flox和Eva1aflox/flox:Alb-Cre交配，選取同窩Eva1aflox/flox為對(duì)照組，Eva1aflox/flox:Alb-Cre為肝細(xì)胞條件性Eva1a基因敲除小鼠進(jìn)行后續(xù)的研究[13]。

小鼠飼養(yǎng)繁殖于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，符合SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物房溫度21 ℃，光-暗周期為12 h。所有小鼠自由采食和飲水，小鼠飼料、飲水、墊料均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。實(shí)驗(yàn)所使用的所有動(dòng)物均經(jīng)過(guò)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠的處置按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 生長(zhǎng)發(fā)育檢測(cè)

雌雄純合肝細(xì)胞條件性Eva1a基因敲除小鼠進(jìn)行交配，觀察有無(wú)胚胎期致死現(xiàn)象。選取對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠每組雌雄各5只，連續(xù)13個(gè)月監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量，每個(gè)月稱量1次，雌雄分別統(tǒng)計(jì)。13個(gè)月后處死小鼠，稱取體質(zhì)量。取血清以及肝臟，觀察肝臟外觀差異。肝臟稱質(zhì)量，測(cè)量肝指數(shù)。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)

分別檢測(cè)雌雄小鼠隨機(jī)血糖和空腹血糖，檢測(cè)血清中總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)濃度，評(píng)估Eva1a基因肝細(xì)胞條件性敲除對(duì)糖脂代謝的影響。檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)和門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)濃度評(píng)估Eva1a基因敲除對(duì)肝細(xì)胞功能的影響。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所以及北京普利萊基因技術(shù)有限公司的商品化試劑盒。

1.4 肝臟石蠟切片的制作以及組織學(xué)檢測(cè)

按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制作肝臟組織石蠟切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色檢測(cè)肝臟組織結(jié)構(gòu)；過(guò)碘酸希夫(periodic acid-schiff, PAS)染色檢測(cè)肝臟組織糖原分布；天狼星紅(Sirus red)染色檢測(cè)肝臟纖維化。

1.5 組織總蛋白提取和 Western blotting分析

在裝有肝組織的1.5 mL勻漿管中加入500 μL組織裂解液(RIPA內(nèi)含蛋白酶和磷酸酶抑制劑Cocktail)勻漿2～3次，上清轉(zhuǎn)入新1.5 mL離心管，冰上放置30 min，4 ℃，16 000 r/min離心15 min，上清轉(zhuǎn)入新1.5 mL離心管并進(jìn)行蛋白定量，每組蛋白取100～200 μg，加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮10 min，進(jìn)行15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS-丙烯酰胺膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉；加入相應(yīng)的一抗4 ℃過(guò)夜，TBST充分洗膜3次，然后加入相應(yīng)的DyLight 680/800標(biāo)記的二抗，室溫避光反應(yīng)2 h，)TBST洗膜后使用Odyssey Infrared Imager儀器檢測(cè)信號(hào)。

1.6 組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)分析

取黃豆粒大小的小鼠組織放入1.5 mL勻漿管中，加入1 mL TRIzol，按照常規(guī)方法提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 文庫(kù)，RT-PCR檢測(cè)Eva1a基因mRNA表達(dá)，以Eva1a-F：5′-GCCGCTCTGTACTTTGTC-3′和Eva1a-R：5′- TCTCCCTG ATCATTCGTT -3′為引物，擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min→ 95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，擴(kuò)增 25～35個(gè)循環(huán)→72 ℃ 7 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并分析，GAPDH為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。Eva1a-/-和Eva1a+/+小鼠體質(zhì)量變化和血清ALT、AST濃度變化采用雙因素重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠肝指數(shù)、隨機(jī)血糖、空腹血糖和脂代謝指標(biāo)濃度比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞條件性 Eva1a基因敲除小鼠的鑒定

RT-PCR檢測(cè)Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠肝臟、腦、心臟組織Eva1a基因mRNA表達(dá)，在Eva1a-/-小鼠肝臟中幾乎檢測(cè)不到Eva1a基因mRNA的表達(dá)，而在腦和心臟組織中Eva1a基因mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯變化(圖1A)。Western blotting法檢測(cè)小鼠肝組織Eva1a蛋白的表達(dá)，在Eva1a-/-小鼠肝臟中幾乎檢測(cè)不到Eva1a蛋白的表達(dá)(圖1B)。

圖1 肝細(xì)胞條件性 Eva1a基因敲除小鼠的鑒定Fig. 1 Identification of hepatocyte-specific Eva1a gene knockout miceA: Eva1a mRNA was examined by RT-PCR; B: Eva1a protein was examined by Western blotting; RT-PCR: reverse transcriptase polymerase chain reaction.

2.2 肝細(xì)胞 Eva1a敲除對(duì)生理狀態(tài)下小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

對(duì)肝細(xì)胞Eva1a敲除小鼠和野生型小鼠的長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，Eva1a+/+與Eva1a-/-雄鼠的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Eva1a-/-雌鼠的體質(zhì)量較Eva1a+/+有所升高。在13個(gè)月后處死小鼠，發(fā)現(xiàn)無(wú)論雄性小鼠還是雌性小鼠，Eva1a+/+與Eva1a-/-肝臟的外觀并無(wú)明顯異常。測(cè)量肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)Eva1a-/-雌鼠肝指數(shù)顯著降低(圖2)。

圖2 Eva1a+/+與 Eva1a-/-小鼠生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)Fig.2 Growth monitoring of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: weight monitoring of male; B: weight monitoring of female; C: liver appearance; D: liver index; **P<0.001.

2.3 Eva1a敲除對(duì)小鼠肝功能及糖脂代謝指標(biāo)的影響

在2個(gè)月、5個(gè)月和1年的Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠血清中ALT、AST濃度均在正常范圍內(nèi)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠的隨機(jī)血糖和空腹血糖比較，兩組小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，檢測(cè)了小鼠的血清中脂質(zhì)代謝指標(biāo)，血清中總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯、三酰甘油、HDL-C和LDL-C濃度均在正常范圍內(nèi)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 Eva1a+/+與 Eva1a-/-小鼠肝功能及糖脂代謝指標(biāo)檢測(cè)Fig.3 Liver function, blood glucose and lipid detection of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: ALT; B: AST; C: blood glucose; D: fasting blood glucose; E: total cholesterol; F: free cholesterol; G: cholesteryl ester; H: triglyceride; I: HDL-C; J: LDL-C; ALT: alanine aminotransferase; AST： aspartate aminotransferase; HDL-C： high density lipoprotein cholesterol; LDL-C： low density lipoprotein cholesterol.

2.4 Eva1a敲除對(duì)小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、糖原以及膠原纖維分布的影響

對(duì)Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠肝臟的HE 染色發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯異常。PAS 染色主要用于檢測(cè)組織中的糖類，Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠糖原分布無(wú)明顯差異。天狼星紅染色可以將膠原染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠肝臟組織膠原纖維無(wú)顯著異常(圖4)。

2.5 Eva1a敲除對(duì)小鼠肝細(xì)胞自噬的影響

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Eva1a+/+小鼠相比較，Eva1a-/-小鼠的LC3略有下調(diào)，SQSTM1/P62蛋白無(wú)明顯差異。發(fā)現(xiàn)無(wú)論MTOR信號(hào)通路以及LKB/AMPK信號(hào)，Eva1a+/+與Eva1a-/-小鼠均無(wú)明顯異常，在正常飼養(yǎng)條件下，Eva1a-/-小鼠的自噬沒(méi)有明顯的改變(圖5)。

圖5 Eva1a+/+與 Eva1a-/-小鼠肝組織自噬表型以及信號(hào)通路Fig.5 Autophagy phenotype and signal pathway detection of Eva1a+/+ and Eva1a-/- miceA: LC3B and SQSTM1 detection by Western blotting; B: LKB/AMPK protein detection; C: MTOR/RPS6KB1/ PRS6 protein detection.

3 討論

Eva1a是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心首次報(bào)道的與自噬與凋亡相關(guān)基因。分子機(jī)制的研究[8]證明Eva1a可以通過(guò) C 端 與 ATG16L1 的 WD 結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)自噬體的形成。進(jìn)一步的研究[9-10]發(fā)現(xiàn)Eva1a在腦中能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[9]，在心臟中能影響心肌重塑[10]。最新研究[12]顯示Eva1a誘導(dǎo)的自噬在肝癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Eva1a在肝臟中高表達(dá)，本研究分析了Eva1a肝細(xì)胞條件性敲除對(duì)生理狀態(tài)下小鼠生長(zhǎng)發(fā)育、肝功能、糖脂代謝、肝臟組織結(jié)構(gòu)、及自噬方面的影響，結(jié)果顯示Eva1a基因敲除小鼠在體質(zhì)量、行為、血清學(xué)指標(biāo)、肝臟組織結(jié)構(gòu)方面無(wú)明顯異常，Eva1a敲除對(duì)小鼠肝細(xì)胞自噬無(wú)顯著影響，這提示Eva1a可能對(duì)于肝臟的發(fā)育及功能不是必要的。 這與部分關(guān)鍵的自噬相關(guān)基因不同，例如Atg5、Atg7敲除小鼠肝臟會(huì)自發(fā)形成腫瘤[14]，Vps34以及Rack1肝敲除小鼠出現(xiàn)肝臟腫脹[15]。Eva1a敲除對(duì)于肝臟基礎(chǔ)的自噬沒(méi)有明顯影響，這可能是由于Eva1a并不是自噬過(guò)程不可缺少的基因，可能起到輔助作用。

mTOR 通路是自噬調(diào)控中非常重要的信號(hào)通路。mTOR 通路的激活能抑制自噬， 其下游底物RPS6KB1-RPS6 能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。而mTOR上游通路包括PIK3C3/AKT和LKB1/AMPK等，能通過(guò)影響 mTOR 通路影響自噬。前期研究[7]表明Eva1a可能通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬發(fā)生，而Eva1a敲除會(huì)通過(guò)Pik3c3-Akt-mTOR 通路影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[9]，通過(guò) mTOR 通路影響心肌重塑[10]，因此本研究在肝組織中檢測(cè)了相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá), Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常飼養(yǎng)條件下，滅活Eva1a的小鼠肝細(xì)胞LKB1/AMPK以及mTOR通路相應(yīng)分子的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。與在腦和心臟的結(jié)果并不一致，也許是不同的組織或細(xì)胞的反應(yīng)不同所致。

隨著肥胖和代謝綜合征的流行，NAFLD 已成為我國(guó)第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生物化學(xué)指標(biāo)異常的首要原因。NAFLD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)在多認(rèn)同Day 和James 提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，即第一次打擊為高胰島素血癥和胰島素抵抗引起單純肝細(xì)胞脂肪變性；第二次打擊為氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化、炎性細(xì)胞因子釋放、線粒體功能障礙等因素誘導(dǎo)肝臟炎性反應(yīng)、肝細(xì)胞變性壞死和肝纖維化、肝硬化的發(fā)生[4]。自噬在脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等應(yīng)激狀態(tài)中起到重要的調(diào)控作用[3,16]。高脂飲食可能通過(guò)PI3K-AKT 通路激活mTOR，激活的mTOR 導(dǎo)致TFEB 磷酸化后無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控自噬及溶酶體基因的表達(dá)，降低肝細(xì)胞的自噬，抑制了脂滴的降解[4, 17-18]，導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生。生理狀態(tài)下Eva1a的功能可能會(huì)在胚胎發(fā)育過(guò)程中被其他基因代償，然而在應(yīng)激狀態(tài)下，基因功能的缺失可能無(wú)法被完全代償，在接下來(lái)的工作中，將在Eva1a肝細(xì)胞條件性敲除鼠中通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD模型，進(jìn)一步探討應(yīng)激狀態(tài)下Eva1a在NAFLD發(fā)生中的作用及分子機(jī)制。