芍藥二酮對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠血管損傷及NLRP3活性的影響

馮雪艷,張慧芹,李 幸,范玉香,劉時文

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是一種以炎癥和血管生成途徑為特征的視網(wǎng)膜微血管疾病[1]。它是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是導致成人失明的主要原因之一[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病引起的視網(wǎng)膜損害與慢性低級別炎癥狀態(tài)下的相關通路和介質(zhì)有關,這導致血視網(wǎng)膜屏障的通透性增加,導致缺血事件,驅(qū)動血管生成進入視網(wǎng)膜[3]。預計到2030年全球糖尿病患者總數(shù)將增加至3.66億人,成為全球健康的主要威脅之一。在糖尿病的血管并發(fā)癥方面,35%的糖尿病患者有某種形式的DR,7%的患者有增生性DR(Proliferative DR,PDR),7%的患者有糖尿病黃斑水腫,10%的患者處于視覺威脅階段[4]。因此,尋找有效預防DR的措施和治療藥物是目前研究的熱點。

芍藥二酮是一種從芍藥根中分離得到的新萜類化合物[5]，其具有抑制人單核細胞白細胞介素-1β(IL-1β)、環(huán)氧合酶(CO)、血栓烷A合成酶(TX)和5-脂氧合酶(LO)活性的作用[6]。近幾年有研究發(fā)現(xiàn),芍藥二酮減輕了氧化應激和炎癥介導的血管和肝臟疾病[7]，而炎癥在DR發(fā)病機制中起著關鍵的作用[8]。因此,提示芍藥二酮可能對DR具有治療作用。

本研究旨在探索芍藥二酮對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療效果和可能的作用機制,尤其是對視網(wǎng)膜血管炎性和血管通透性的影響，進一步為DR的臨床用藥提供更直接的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠,體重180～220 g,購自河北省實驗動物中心。大鼠被置于受控環(huán)境(21～23 ℃,12 h光照/12 h黑暗周期,濕度55%～60%)中,以標準的鼠糧和隨意飲水喂養(yǎng)。所有動物實驗操作均嚴格遵循國家衛(wèi)生研究院實驗室動物護理和使用指南中所述的方法。

1.1.2 藥品和試劑 芍藥二酮購自北京范德生物科技有限責任公司,需用檸檬酸緩沖液(pH=7.4)進行溶解。伊文思藍染料購自北京Solarbio公司,使用前將伊文思藍染料溶解在生理鹽水中，配制成濃度為45 mg/ml的溶液。戊巴比妥鈉購自中國北京國藥集團股份有限公司。熒光素(AK-FLUOR)購自Sigma公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司。SYBR Premix EX TaqTMI試劑盒購自TaKaRa公司。所有引物均在上海生工合成。一抗NLRP3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-1β)、凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、GAPDH抗體購自Abcam公司。一抗血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)、細胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和熒光二抗Alexa Fluor 568購自Thermo Fisher 公司。二抗Goat Anti-Rabbit IgG Antibody(H&L)購自金斯瑞生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立[9]隨機選取8周齡的SD大鼠40只進行造模,先給予高脂高糖的飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周,4周后,大鼠禁食不禁水12 h,稱重并腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。STZ給藥48 h后,采集大鼠尾部靜脈血進行檢測,血糖超過16.7 mmol/L的大鼠為糖尿病,用于糖尿病大鼠模型。

1.2.2 分組及藥物干預 將造模成功的大鼠給予芍藥二酮灌胃治療。隨機分為4組(n=10),分別是模型組,芍藥二酮低(25 mg/kg)、中(50 mg/kg)、高(100 mg/kg)劑量組,另設對照組(n=10),同時給予對照組和模型組等體積的檸檬酸緩沖液灌胃。每天1次,連續(xù)4周。

1.2.3 組織的收集 末次給藥24 h后,一部分小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥酸進行麻醉處死,取其左右眼的視網(wǎng)膜組織,左眼的視網(wǎng)膜組織保存至-80 ℃,待后續(xù)蛋白質(zhì)的收集;右眼的視網(wǎng)膜組織固定在4%的甲醛溶液中24 h,再進行15% EDTA脫鈣處理、酒精梯度(分別為100%、95%和70%)脫水、石蠟包埋、切片(3 μm),保存至4 ℃,待后續(xù)病理觀察使用。

1.2.4 大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)觀察 冰凍切片在蘇木精溶液中染色5 min,用水沖洗。分色過程在鹽酸酒精溶液中進行,最后加水終止。在氨水溶液中進行發(fā)藍,加水終止發(fā)藍。切片浸泡在伊紅溶液中5 min,用水沖洗。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂固定封片,光學顯微鏡下觀察載玻片。測量全視網(wǎng)膜的厚度(內(nèi)界膜和色素上皮之間)并計算神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)細胞的數(shù)量(每100 μm細胞)。在每個半球的相鄰位置進行3次測量,9次測量取平均值。每組記錄3只眼的平均值作為代表值。對三組的結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 大鼠視網(wǎng)膜組織血管通透性測量[10]采用熒光素檢測血管造影和伊文思藍評價各組大鼠的血管通透性。熒光素血管造影用托品酰胺眼液擴張瞳孔,氯胺酮和甲苯噻嗪深度麻醉大鼠后,腹腔注射150 μl AK-FLUOR(1% W/V)。視網(wǎng)膜血管滲漏用微米級IV成像。注射染料后5 min內(nèi)拍照。為額外測量血管滲透量,大鼠通過尾靜脈注射100 μl伊文思藍染料,2 h后用CO2安樂處死老鼠,剝離眼球并仔細取出視網(wǎng)膜,放入含有100 μl甲酰胺的離心管中,在55 ℃下培養(yǎng)48 h,然后將離心管轉(zhuǎn)移到96孔板上,測量610 nm處的吸光度。

1.2.6 免疫熒光組織化學 將視網(wǎng)膜組織冰凍切片從4 ℃取出進行沖洗,再用檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)進行抗原去蔽。用1%牛血清白蛋白(BSA)和5%正常山羊血清在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中封閉載玻片上的組織切片,用PBS洗滌,與一抗NLRP3孵育2 h,稀釋1∶200。將載玻片洗凈,然后與相應的1∶500稀釋的二抗在適當?shù)姆忾]液中孵育1 h,室溫置于黑暗中。用DAPI進行細胞核染色10 min,再用PBS洗滌,用含有淬滅劑的封片劑進行封片。在徠卡共聚焦顯微鏡下拍照,用Image J軟件對NLRP3熒光強度進行分析。每個視網(wǎng)膜切片隨機選擇5個視野。

1.2.7 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 使用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜組織總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA質(zhì)量,將A260/A280比值為1.8～2.0的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green Real-Time PCR Master進行qRT-PCR。PCR反應條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 s,進行40個循環(huán);60 ℃30 s，72 ℃ 30 s。擴增是一式3份進行。使用2-△△Ct法計算每個基因的相對表達水平(使用GAPDH作為內(nèi)參)。所有引物序列如表1。

表1 引物序列

1.2.8 Western blot法檢測 將保存在-80 ℃的視網(wǎng)膜組織取出放置冰上,用組織勻漿器進行研磨,加入RIPA裂解液于4 ℃裂解30 min,然后在4 ℃條件下,以20 000 g離心15 min。采用BCA蛋白濃度法測定上清的蛋白含量。將樣品與樣品緩沖液(4×sample buffer)煮10 min。使用10%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白樣本,每泳道上樣10 μl進行電泳,然后轉(zhuǎn)膜,再予以下一抗進行孵育(4 ℃孵育過夜):Caspase-1、IL-1β、ASC、VEGF、PECAM-1、ICAM-1,再予相應的二抗室溫孵育1 h,用含有Tween 20的Tris緩沖鹽水洗滌印跡,最后用ECL顯影液進行顯影并拍片,用Image-J進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計分析均采用GraphPad Prism 6.0軟件進行。數(shù)據(jù)以平均標準誤差(SEM)表示,兩組之間的比較采用標準雙尾無配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài) 在光學顯微鏡下,HE染色顯示,視網(wǎng)膜組織可明顯分為5層,分別是GCL(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層)、IPL(內(nèi)網(wǎng)狀層)、INL(內(nèi)部核層)、OPL(外網(wǎng)狀層)和ONL(外顆粒層)。對照組大鼠視網(wǎng)膜表面光滑,GCL、INL和ONL層細胞排列緊密、整齊有規(guī)律；模型組視網(wǎng)膜內(nèi)界出現(xiàn)明顯水腫,每一層分層異常,細胞排列疏松且無序,總視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度顯著低于對照組;而相對于模型組,芍藥二酮中劑量組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界水腫明顯減輕,細胞排列相對整齊,總視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度增多,而芍藥二酮低、高劑量組對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的改善效果不如中劑量組，見圖1。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色

2.1 芍藥二酮改善了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性 為了研究芍藥二酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性的影響,我們檢測了血管造影并評價了各組大鼠的血管通透性。結(jié)果顯示,相比于對照組,模型組大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏增加;而相對于模型組,芍藥二酮低、中、高劑量組抑制了大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏,但芍藥二酮低、高劑量組對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管通透性的改善效果不如中劑量組，見圖2。

圖2 大鼠視網(wǎng)膜組織伊文斯藍染色

2.2 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的增加 血管生成介質(zhì)的表達與血管通透性和血管形成有關。因此,我們檢測了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達上調(diào);而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組下調(diào)了PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖3。

圖3 大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的蛋白表達

2.3 芍藥二酮減少了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3陽性細胞數(shù)量 炎癥是DR發(fā)病機制的關鍵因素,影響血管的形成[8]。因此,我們檢測了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體蛋白的表達。免疫熒光組織化學染色結(jié)果顯示,NLRP3炎性小體主要在GCL和IPL層組成性表達。與對照組相比,模型組NLRP3陽性細胞增多;而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組NLRP3陽性細胞均減少,芍藥二酮中劑量組NLRP3陽性細胞數(shù)量顯著減少，見圖4。

圖4 大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3的蛋白表達

2.4 芍藥二酮抑制了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體的激活 本研究檢測了各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-1、IL-1β、ASC的表達上調(diào);而與模型組相比,芍藥二酮低、中、高劑量組Caspase-1、IL-1β、ASC的表達下調(diào),其中芍藥二酮中劑量組變化最顯著，見圖5。

圖5 大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎性小體激活標志物的蛋白表達

3 討論

DR是糖尿病最常見的并發(fā)癥,也是全球糖尿病患者視力下降的主要原因[11]。臨床上,DR大致分為早期非增生性DR 和晚期增生性DR,伴有和不伴有糖尿病性黃斑水腫的發(fā)展[12]。DR涉及多個相互關聯(lián)的通路,炎癥就是其中之一,它會對視網(wǎng)膜的神經(jīng)和血管成分產(chǎn)生不良影響。持續(xù)的炎癥會引起生化和分子的變化,最終導致糖尿病視網(wǎng)膜病變的并發(fā)癥和視力下降[13]。DR的病因和病理已經(jīng)被廣泛研究,但其治療的選擇很少。因此,研究治療DR的藥物極其重要。

芍藥二酮是具有較強抑制人體IL-1β活性的一類新型萜類化合物,研究發(fā)現(xiàn),它還是多種酶的抑制劑[5-6]。本研究初步探討了芍藥二酮對DR的保護作用及分子機制。研究發(fā)現(xiàn),芍藥二酮可以改善DR模型大鼠的視網(wǎng)膜形態(tài),包括改善了GCL、INL及ONL層分層和細胞排列紊亂,并抑制了全視網(wǎng)膜厚度和GCL、INL、ONL層細胞密度的降低;此外,芍藥二酮還改善了DR模型大鼠視網(wǎng)膜血管通透性,降低了視網(wǎng)膜微血管的滲漏,抑制了視網(wǎng)膜新生血管的形成。因此,芍藥二酮對DR誘發(fā)的視網(wǎng)膜組織損傷具有抑制作用。

本研究探討了芍藥二酮抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織損傷的分子機制。由于血管通透性和新生血管形成受血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的調(diào)控[14-16]，我們檢測了DR大鼠視網(wǎng)膜組織中血管生成介質(zhì)的表達,發(fā)現(xiàn)芍藥二酮降低了血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,由此降低了血管滲漏,抑制了視網(wǎng)膜血管的通透性和新生血管形成。此外,有研究報道,NLRP3炎癥小體相關的炎癥分子在糖尿病視網(wǎng)膜組織中表達增強,可能有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變中新生血管形成[17]。NLRP3炎性小體,是由NLRP3、ASC和Caspase-1組成[18]。NLRP3成分識別危險信號,并將蛋白復合物ASC組裝起來激活Caspase-1,導致促炎性細胞因子IL-1β蛋白水解分泌,進而激活NLRP3炎性小體。最新研究表明,通過調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的激活，可以改善糖尿病視網(wǎng)膜病變[19]。為此,我們檢測了大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎癥小體及其激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達。本研究結(jié)果顯示,芍藥二酮降低了NLRP3炎癥小體及其激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC的表達,進而抑制了NLRP3炎癥小體的激活。因此,芍藥二酮抑制DR大鼠視網(wǎng)膜組織GCL細胞數(shù)量的減少和血管滲漏可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實現(xiàn)的。

綜上所述,芍藥二酮改善了DR大鼠的視網(wǎng)膜組織形態(tài)和血管通透性,降低了DR大鼠視網(wǎng)膜組織中NLRP3炎癥小體激活標志物Caspase-1、IL-1β、ASC和血管生成介質(zhì)PECAM-1、ICAM-1、VEGF的表達,可能是通過抑制NLRP3炎癥小體激活實現(xiàn)。