用于3種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的熒光免疫芯片研發(fā)及其應(yīng)用

崔海峰，賈芳芳，陳立軍，武妹霞，惠光朋，何方洋*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京；3.河北省灤州市農(nóng)業(yè)村局，河北 灤州）

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥使用品種多、用量大，可以有效保障或提高農(nóng)作物產(chǎn)量[1]，但長(zhǎng)期大規(guī)模不合理使用，會(huì)造成食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留，損害消費(fèi)者的身體健康；另一方面，農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，還會(huì)不可避免地殘留在飼料當(dāng)中，致使其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，嚴(yán)重者可危害動(dòng)物健康甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡，且殘留在動(dòng)物產(chǎn)品中的農(nóng)藥也可能危害人類健康[2]。目前針對(duì)農(nóng)藥殘留及其代謝物的檢測(cè)主要是依靠色譜法、質(zhì)譜法等儀器分析手段[3-6]，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)定性與定量分析，但檢測(cè)費(fèi)用高、周期長(zhǎng)，且需要專門的操作人員，不適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行低成本快速篩選。而免疫分析技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為最具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ姆治黾夹g(shù)之一[7]。

常見的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫層析技術(shù)。趙妍等[8]建立了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，對(duì) 8種擬除蟲菊酯具有較高的靈敏度，IC50范圍在8.69 ～ 344.97 ng/ml；LAN 等[9]基于廣譜特異性單克隆抗體，建立了同時(shí)檢測(cè)蔬菜水果中克百威及其代謝物 3-羥基克百威的 ELSIA方法；周嘉明等[10]建立了基于膠體金免疫層析法的三氯殺螨醇快速檢測(cè)試紙條的研制方法，其對(duì)茶葉中三氯殺螨醇檢測(cè)限為0.2 mg/kg，檢測(cè)時(shí)間8 min；Sheng等[11]建立了乙氧氟草醚直接和間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法，IC50分別為 10.27 ng/ml和2.76 ng/ml。以上建立的用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)ELISA方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，但仍需較為繁瑣的操作步驟，檢測(cè)速度相對(duì)較慢，不能完全滿足農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的要求。相對(duì)而言，免疫層析技術(shù)檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單，而且熒光層析法的靈敏度和準(zhǔn)確性較膠體金法更勝一籌[12]。因此，本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合，研制了 3種農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)免疫芯片，以滿足農(nóng)藥多殘留現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)材料 胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料，購自于北京某超市。

1.1.2 儀器 克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物、克百威單克隆抗體，毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物、毒死蜱單克隆抗體，滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物、滅蠅胺單克隆抗體，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制；克百威標(biāo)準(zhǔn)品、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98.0 %，美國Sigma公司；FT04C時(shí)間分辨熒光微球（表面連接有-COOH基團(tuán)，激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 615 nm），蘇州為度生物技術(shù)有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物（MES）、雞 IgY、羊抗雞IgY，美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（NC膜），德國 Sartorius公司；樣品墊、吸水墊、PVC底板，上海捷寧生物科技有限公司。LGJ-50C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；XYZ3050膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng)，美國 BIODOT公司；AQ4200數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；KQ2200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；M8多功能振蕩混合器，上海邁皋科學(xué)儀器有限公司；芯片分析儀，北京勤邦生物技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；低速離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 活化緩沖液：0.05 mol/L MES，pH6.0。偶聯(lián)緩沖液：0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液（BB），pH 8.0。洗滌緩沖液：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（PB），pH 7.4。封閉緩沖液：含0.04 mol/L鹽酸羥胺及 1 % 酪蛋白的中性 PB。貯存緩沖液：含0.05 % Proclin 300及0.1 % 酪蛋白的中性PB。樣本提取液：0.02 mol/L PB + 5 %甲醇。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）熒光微球標(biāo)記抗體的制備：①活化：取 50 μl 300 nm粒徑的熒光微球懸液，用活化緩沖液 MES 10倍稀釋后，等量分裝于棕色避光離心管中，渦旋混勻，12 000 r/min、4 ℃ 離心15 min，棄上清；同法用MES洗滌1次，離心棄上清。稱取EDC和NHS各10 mg，分別用1 ml MES溶解后，取 5 μl EDC溶液及 20 μl NHS溶液加入離心管中，補(bǔ)加 MES重懸至離心前體積，200次/min振蕩，室溫反應(yīng) 15 min。②偶聯(lián)：活化處理后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄上清；用BB洗滌1次，離心棄上清。取克百威、毒死蜱、滅蠅胺單克隆抗體（檢測(cè)用）及雞IgY（質(zhì)控用），使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，分別以 0.2～0.8 mg/ml的添加量加入各離心管中，以 BB作為稀釋液，重懸各份熒光微球至離心前體積，200次/min震蕩，室溫反應(yīng) 4 h。③封閉：偶聯(lián)結(jié)束后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min，棄上清；用封閉緩沖液重懸至離心前體積，200次/min振蕩，室溫反應(yīng) 1 h。④貯存：封閉結(jié)束后的微球偶聯(lián)物懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min，棄上清；用 PB洗滌 1次，離心棄上清。洗滌后的微球偶聯(lián)物用貯存緩沖液洗滌 2次，重懸至離心前體積，4 ℃ 避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）檢測(cè)試劑的制備：按適當(dāng)比例稀釋、混勻檢測(cè)微球與質(zhì)控微球的偶聯(lián)物懸液，即制成熒光微球檢測(cè)試劑。平底管中添加 100 μl稀釋懸液，-50 ℃ 預(yù)凍 3 h，真空干燥 15 h，取出后加蓋、加干燥劑密封，置4 ℃ 避光保存。

（3）熒光免疫芯片的制備：如圖 1所示，將一定濃度的克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測(cè)線，T1）、毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測(cè)線，T2）、滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物（檢測(cè)線，T3）和羊抗雞 IgY（質(zhì)控線，C線）分別點(diǎn)陣包被在 NC膜上，并根據(jù)層析方向由下至上，將樣品墊、NC膜、吸水墊依次粘貼于 PVC底板上，將組裝好的板條切割成寬為 8 mm的試紙條，加干燥劑封裝備用。

圖1 熒光免疫芯片結(jié)構(gòu)圖

（4）樣品處理與檢測(cè)：取新鮮樣品擦去泥土，剪碎成小于 1 cm 見方的碎片，稱取 2.00±0.05 g樣品至 10 ml聚苯乙烯離心管中，加入4 ml樣本提取液，振蕩 30 s，靜置 1 min，吸取400 μl上層液體加入制備的檢測(cè)試劑中，連續(xù)吹打 5次混勻，靜置 3 min，即為樣品待檢液。將制備的熒光免疫芯片插入檢測(cè)試劑中，室溫反應(yīng)5 min，用芯片分析儀讀取 T、C線的熒光強(qiáng)度，計(jì)算 T/C值，T/C≥1，判為陰性（-）；T/C＜1，判為陽性（+）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)限

在空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品中分別添加克百威、毒死蜱、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品至表1所列的濃度，用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù) 3次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限。由表1結(jié)果可知，當(dāng)樣品中克百威、毒死蜱、滅蠅胺濃度分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg時(shí)，各農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果為陽性，因此確定該熒光免疫芯片的檢測(cè)限為：克百威 0.02 mg/kg、毒死蜱0.5 mg/kg、滅蠅胺0.5 mg/kg。

表1 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2 特異性

取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨各 1份，在其中分別添加其他常見的 10種農(nóng)藥至濃度為 10 mg/kg，用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè)，每種藥物重復(fù)3次，判定芯片的特異性。由表2可知，樣本中常見的其他農(nóng)藥對(duì) 3個(gè)點(diǎn)陣條帶均不產(chǎn)生干擾，結(jié)果都顯示陰性，說明本芯片對(duì) 3種藥物特異性較好。

表2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.3 準(zhǔn)確性

取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品各10份，分別添加3種農(nóng)藥至2.1確定的檢測(cè)限濃度，用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù) 3次，計(jì)算假陽性率和假陰性率，結(jié)果見表 3。由結(jié)果可知，對(duì)陰性樣本、陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，無假陽性、假陰性出現(xiàn)，結(jié)果判定準(zhǔn)確，說明本免疫芯片可以對(duì)果蔬樣本中的克百威、毒死蜱、滅蠅胺3種農(nóng)藥同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析。

表3 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 關(guān)于動(dòng)物飼料方面檢測(cè)的適用性

由于市場(chǎng)需求，本研究暫時(shí)只測(cè)定了胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本，后續(xù)研究還會(huì)增加樣本進(jìn)行測(cè)定。本研究制備的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)熒光免疫芯片，只需要根據(jù)樣本特點(diǎn)調(diào)整其前處理方法，即能夠檢測(cè)出該樣本的農(nóng)藥殘留量，因此，本芯片對(duì)于其他動(dòng)物飼料方面的檢測(cè)，同樣適用。

3 結(jié)論

時(shí)間分辨免疫熒光是20世紀(jì)80年代在傳統(tǒng)免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，使用具有獨(dú)特?zé)晒馓卣鞯蔫|系元素及其螯合物，靈敏度高、特異性好、無放射元素污染[13]；生物芯片技術(shù)是采用微量點(diǎn)樣等方法，將生物大分子有序地固化在載體表面組成密集的點(diǎn)陣列，具有高通量、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)[14]。本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合，以硝酸纖維素膜為載體，農(nóng)藥抗原為捕獲探針，制作了一種包含 3種抗原抗體組合的免疫芯片，可同時(shí)檢測(cè)甲克百威、毒死蜱、滅蠅胺，檢測(cè)限分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg，假陰性率、假陽性率均為 0，準(zhǔn)確度較高；對(duì)常見的其他 10種農(nóng)藥無交叉反應(yīng)，特異性較好；檢測(cè)速度快，從制樣到得出結(jié)果僅需15 min。本方法將傳統(tǒng)試紙條的劃線模式改成點(diǎn)陣形式，可以有效避免劃線引起的多項(xiàng)目之間的顯色干擾。該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中多種農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩查和檢測(cè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。