謝文靜，凌敏，梁婕，范姿，唐萌,#，卞倩,*

1. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210009 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009 3. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166

空氣污染是一個日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，造成在世界范圍內(nèi)超300萬人過早死亡，這其中的死因包括肺癌、慢性阻塞性肺疾病等相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]。柴油廢氣顆粒物(DEP)是空氣污染物重要來源之一，由固體碳顆粒物和灰顆粒、揮發(fā)性有機化合物和硫化物組成[3]。有證據(jù)表明，DEP與呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)生和肺功能損傷有關(guān)[4]。也有研究進一步證實，DEP暴露致細胞線粒體功能[5]及氨基酸轉(zhuǎn)運體過表達[6]等。在受到DEP的外來刺激后，支氣管上皮細胞(HBE)是第一道接觸屏障，產(chǎn)生細胞毒性，引發(fā)炎癥反應(yīng)，甚至對細胞存活率產(chǎn)生影響[7]。因此，在DEP致呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的機制研究中，細胞毒性實驗是研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

在檢測細胞毒性的方法中，由于實驗易于操作且結(jié)果易于標(biāo)準(zhǔn)化，通常將2種常規(guī)測定方法用于體外細胞毒性評估：Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和實時無標(biāo)記細胞分析系統(tǒng)(real-time cell analysis system, RTCA)[8]。CCK-8法是一種檢測細胞存活和生長情況的經(jīng)典方法，試劑內(nèi)的WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜，細胞毒性越大，則顏色越淺，吸光度值越小，對于同一細胞，吸光度值和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系，是常用的檢測顆粒物致細胞毒性的傳統(tǒng)實驗方法。RTCA是一種檢測細胞毒性的新技術(shù)，是一種建立在阻抗基礎(chǔ)上的瞬時細胞電感應(yīng)連續(xù)記錄系統(tǒng)，電阻和細胞是否黏附、數(shù)量、體積大小及形態(tài)變化密切相關(guān)，通過檢測電阻值進而實時動態(tài)監(jiān)測細胞毒性反應(yīng)[9-10]。已有文獻報道過CCK-8法檢測DEP致細胞的毒性[11]，但未見RTCA法檢測DEP致肺相關(guān)細胞毒性的相關(guān)報道。在研究細胞毒性機制方面，RTCA克服CCK-8法定時檢測的局限，可以實時監(jiān)測細胞的狀態(tài)。因此將這2種方法進行比較，分析RTCA是否能替代傳統(tǒng)的CCK-8法。

在本研究中，我們探討了CCK-8檢測DEP致支氣管上皮細胞(HBE)的細胞存活率的變化，RTCA法檢測DEP致HBE細胞在標(biāo)準(zhǔn)化細胞指數(shù)(NCI)值變化，比較2種方法檢測結(jié)果的差異，并用細胞凋亡實驗對結(jié)果進行驗證。比較這2種方法檢測DEP致HBE細胞毒性的結(jié)果靈敏度，以及適用范圍和局限性，這對接下來研究DEP致呼吸系統(tǒng)相關(guān)細胞毒性的機制提供基礎(chǔ)。同時，比較了2種DEP致HBE細胞毒性的差異，分析產(chǎn)生差異的原因，為后續(xù)的機制研究提供支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藥品與試劑

HBE細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所(中國)。柴油廢氣標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物(貨號：Standard Reference Material 1650b (SRM 1650b); Standard Reference Material 2975 (SRM 2975))購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。CCK-8試劑購自上海碧云天公司(中國)。細胞凋亡Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京諾維贊公司(中國)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司。

1.2 儀器設(shè)備

RTCA儀器(xCELLigence RTCA，Agilent，美國)；酶標(biāo)儀(SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，中國)；流式細胞儀(Accuri C6，BD，美國)

1.3 細胞培養(yǎng)及處理

HBE細胞在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清，1%的青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基。每2天以1∶3的比例傳代細胞。實驗使用對數(shù)生長期細胞。

1.4 DEP懸液制作

將2種DEP標(biāo)準(zhǔn)品SRM 1650b和SRM 2975在高精度微量天平上稱重，分別用Hanks緩沖液混懸制成2 g·L-1的儲備懸液。將儲備懸液超聲處理20 min，制備200 mg·L-1的使用懸液。體外細胞刺激實驗前，超聲處理使用懸液20 min，并用DMEM培養(yǎng)基稀釋至不同的染毒濃度，分別是0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1。

1.5 CCK-8法檢測細胞毒性

用CCK-8試劑進行評估細胞毒性的測定。將HBE細胞以1×105cells·mL-1的細胞密度接種到96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL后，放置在37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h。然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的SRM 1650b和SRM 2975(0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1)，每孔100 μL，以Hanks緩沖液為對照，分次孵育6、12、24和48 h。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。最后，向每個孔中加入10 μL CCK-8，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度值。細胞存活率=DEP組吸光度值/Hanks對照組吸光度值×100%。細胞存活率越低，說明DEP對細胞的損傷程度越大。

1.6 細胞種植實驗

通過微陣列的電極設(shè)計，RTCA測量細胞電極阻抗的變化，將測定的電阻抗實時轉(zhuǎn)化為細胞指數(shù)(cell index, CI)，在相同培養(yǎng)條件下，電極上的細胞數(shù)量越多，則CI值越大，CI值可實時反映細胞生長狀態(tài)，進而對細胞狀態(tài)進行定量。在E-Plate孔板中每孔加50 μL培養(yǎng)基，置RTCA儀器上檢測基線，確保所有孔的CI均<0.1。在孔中加100 μL充分混勻的不同濃度的細胞懸液，細胞懸液濃度分別為0.6×105、0.8×105、1×105和1.2×105cells·mL-1。將培養(yǎng)板于超凈臺中靜置30 min，轉(zhuǎn)至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中的RTCA儀器上，開始檢測，每組3個復(fù)孔。

1.7 RTCA法檢測細胞毒性

在E-Plate的每孔中加50 μL培養(yǎng)基，置RTCA儀器上檢測基線。HBE細胞密度為2×105cells·mL-1，每孔加入細胞懸液50 μL接種于E-Plate孔板中。將孔板放置于RTCA檢測儀器20～24 h后，分別加入配制好的SRM 1650b和SRM 2975染毒液50 μL，使每孔最終染毒濃度分別為0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1，于72 h后停止檢測，每組3個復(fù)孔。比較各組之間的標(biāo)準(zhǔn)化細胞指數(shù)(normalized cell index, NCI)。NCI計算方法為將所有組數(shù)據(jù)在暴露的時間點的CI值設(shè)置為分母，所有的CI值為分子，相除得出的值就是NCI值[12]，這可避免各組之間因細胞種板數(shù)的差異影響結(jié)果。NCI值越低，說明DEP對細胞的損傷程度越大。

1.8 細胞凋亡實驗

HBE細胞以1×105cells·mL-1的細胞密度接種到六孔板，每孔加入的懸液體積為2 mL。細胞貼壁后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別向每孔加入2 mL的28 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975懸液，將HBE細胞暴露其中6 h；加入2 mL的14 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975懸液，將HBE細胞暴露其中12 h；加入2 mL的14 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975懸液，將HBE細胞暴露其中24 h；加入2 mL的7 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975懸液，將HBE細胞暴露其中48 h。用不含EDTA的胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，進行Annexin V-FITC/PI染色，樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 CCK-8實驗結(jié)果

分別用0、3.5、7、14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE細胞6、12、24和48 h后，進行CCK-8測定。由圖1(a)可知，暴露6 h后，與對照組相比，染毒濃度為56 mg·L-1的SRM 1650b組，測得的細胞活性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暴露12 h和24 h后，與對照組相比，染毒濃度為28 mg·L-1和56 mg·L-1的SRM 1650b組，測得的細胞活性率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暴露48 h后，與對照組相比，染毒濃度為14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b組，測得的細胞活性率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由圖1(b)可知，暴露6 h和12 h后，與對照組相比，染毒濃度為14、28和56 mg·L-1的SRM 2975組，測得的細胞活性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暴露24 h和48 h后，與對照組相比，染毒濃度為7、14、28和56 mg·L-1的SRM 2975組，測得的細胞活性率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法檢測柴油廢氣顆粒物(DEP)致支氣管上皮細胞(HBE)細胞存活率的變化注：(a)和(b)分別為CCK-8法檢測柴油廢氣標(biāo)準(zhǔn)參考顆粒物(SRM 1650b和SRM 2975)染毒HBE細胞6、12、24和48 h后致細胞存活率變化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照相比。Fig. 1 The cell viability of human bronchial epithelial (HBE) cells induced by diesel exhaust particles (DEP) was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assayNote: (a) and (b) show that after DEP Standard Reference Material (SRM 1650b and SRM 2975) induced HBE cells, the changes of cell viability were detected by CCK-8 assay for 6, 12, 24 and 48 h; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control.

2.2 RTCA實驗結(jié)果

2.2.1 細胞種植實驗

將HBE細胞接種于E-Plate 16板中，每組細胞密度分別設(shè)為0.6×104、0.8×104、1×104和1.2×104cells·孔-1，設(shè)3個復(fù)孔，由RTCA實時監(jiān)測細胞培養(yǎng)72 h的增殖狀況。由圖2可知，a期為細胞種植后黏附期，b期為對數(shù)增長期，c期為平臺期，其中整個實驗的暴露時間需在對數(shù)增長期內(nèi)。在暴露時間72 h中，細胞密度為0.6×104cells·孔-1和0.8×104cells·孔-1的HBE細胞增長相對平緩，細胞密度為1.2×104cells·孔-1的HBE細胞在60 h后CI值增幅降低，表明細胞生長進入平臺期，因此考慮后續(xù)實驗需要，選用1×104cells·孔-1為實驗條件。

圖2 實時無標(biāo)記細胞分析系統(tǒng)(RTCA)檢測出不同密度HBE細胞培養(yǎng)的細胞指數(shù)(CI)曲線注：a. 細胞種植后黏附期；b. 快速分裂期；c. 平臺期。Fig. 2 Real-time cell analysis system (RTCA) detected Cell Index (CI) of HBE cells at different densitiesNote: a. Cell adhesion period after planting; b. Rapid fission stage; c. Plateau stage.

2.2.2 RTCA法測SRM 1650b和SRM 2975致HBE細胞毒性實驗結(jié)果由圖3(a)和3(c)可知，將HBE細胞接種于E-Plate 16板后，在20 h時分別向每孔加入SRM 1650b和SRM 2975懸液，RTCA實時監(jiān)測NCI的變化。由圖3(b)可知，暴露6 h后，與對照組相比，染毒濃度為28 mg·L-1和56 mg·L-1的SRM 1650b組，測得的NCI值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；暴露12、24和48 h后，與對照組相比，染毒濃度為14、28和56 mg·L-1的SRM 1650b組，測得的NCI值均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由圖3(d)可知，暴露6、12、24和48 h后，與對照組相比，染毒濃度為3.5、7、14、28和56 mg·L-1的SRM 2975組，測得的NCI值均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 RTCA檢測SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE細胞的標(biāo)準(zhǔn)化細胞指數(shù)(NCI)值變化注：(a)和(c)是RTCA實時監(jiān)測SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE細胞的NCI值，(b)和(d)為RTCA法檢測SRM 1650b和SRM 2975染毒HBE細胞6、12、24和48 h后NCI值變化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照相比；attack表示DEP開始對HBE細胞進行暴露處理。Fig. 3 The normalized cell index (NCI) of HBE cells induced by SRM 1650b and SRM 2975 was monitored by RTCANote: (a) and (c) show that RTCA monitored NCI of SRM 1650b-exposed and SRM 2975-exposed HBE cells; (b) and (d) show that after SRM 1650b and SRM 2975 induced HBE cells, the changes of NCI were monitored by RTCA at 6, 12, 24 and 48 h; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control; attack means the HBE cells started to be exposed to DEP.

2.3 細胞凋亡實驗測不同濃度不同時間段SRM 2975和SRM 1650b致HBE細胞毒性實驗結(jié)果

將HBE細胞接種于六孔板后，在6 h時分別向每孔加入28 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975懸液，在12 h時分別向每孔加入14 mg·L-1SRM 1650b和7 mg·L-1SRM 2975懸液，在24 h和48 h時分別向每孔加入14 mg·L-1SRM 1650b和3.5 mg·L-1SRM 2975懸液。由圖4(b)～(e)可見，在暴露的不同時間點，與對照組相比，SRM 1650b和SRM 2975組中測得的細胞凋亡率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 不同濃度不同時間段SRM 1650b和SRM 2975致HBE細胞凋亡率的變化注：(a)是不同濃度不同時間段SRM 2975和SRM 1650b致HBE細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測散點圖；(b),(c),(d),(e)暴露時間分別為6、12、24和48 h；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，與對照相比。Fig. 4 SRM 1650b and SRM 2975 resulted in the changes of apoptosis rate at different concentrations and exposure timesNote: (a) shows that the flow cytometry analyzed apoptosis rate of SRM 1650b-exposed and SRM 2975-exposed HBE cells at different concentrations and exposure times; for (b), (c), (d) and (e), the exposure times were 6,12, 24 and 48 h, respectively; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, compared with the control.

3 討論(Discussion)

本研究發(fā)現(xiàn)，SRM 1650b和SRM 2975均可致HBE細胞損傷，產(chǎn)生細胞毒性，并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)相關(guān)性，且隨著DEP暴露時間的增加細胞活性率下降更為明顯，且在同一染毒濃度、暴露時間，與SRM 1650b相比，SRM 2975致HBE細胞毒性更強。DEP作為一種空氣污染顆粒物，其物理化學(xué)特性高度依賴于燃料和發(fā)動機，是柴油機主要的副產(chǎn)物之一[13-14]。本研究使用的2種暴露物質(zhì)DEP SRM，是在受控條件下生產(chǎn)的，分別代表了重型發(fā)動機(SRM 1650b)和輕型發(fā)動機(SRM 2975)排放的顆粒物[11]，都可以誘發(fā)HBE細胞產(chǎn)生細胞損傷[15]。這2種顆粒物致HBE細胞毒性的差異可能與其理化性質(zhì)有關(guān)。SRM 1650b在超純水中平均粒徑約為0.4259 μm，SRM 2975在超純水中平均粒徑約為0.2216 μm，提示DEP的粒徑大小可能是影響毒性效應(yīng)的因素之一[11]。小粒徑DEP更容易穿透細胞膜進入細胞發(fā)揮毒性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在RTCA實時監(jiān)測中，低濃度的染毒組，比如暴露12 h后14 mg·L-1的SRM 1650b組已經(jīng)表現(xiàn)出有統(tǒng)計學(xué)差異的細胞毒性，而相同時間條件下CCK-8法在28 mg·L-1才檢測出顯著的細胞活性下降，說明在細胞毒性檢測水平上，RTCA法更加靈敏。且由細胞凋亡實驗證實，RTCA法更能發(fā)現(xiàn)不同組之間的統(tǒng)計學(xué)意義差異。細胞毒性的檢測是毒理學(xué)機制研究的基礎(chǔ)，CCK-8法是檢測細胞存活率的傳統(tǒng)方法，被使用了很長時間，RTCA是檢測細胞毒性的新技術(shù)，且本研究得出RTCA相比CCK-8法更適用于檢測DEP致HBE毒性，RTCA靈敏度更高，實用性更高。但在其他研究方面，RTCA是否可以取代CCK-8法仍有疑問，因此本研究分析了2種方法的局限性。

CCK-8法是細胞毒性實驗中的經(jīng)典方法，該方法已被廣泛用于一些細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗，具有技術(shù)成熟、經(jīng)濟實惠等優(yōu)點[16-17]。本研究在用CCK-8法檢測DEP致HBE細胞的毒性實驗中，也發(fā)現(xiàn)其局限性。①由于CCK-8試劑中含有的WST-8在1-Methoxy PMS的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，化學(xué)過程受溫度、時間等因素影響，造成系統(tǒng)誤差，對實驗結(jié)果造成影響。②操作步驟繁瑣，從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。③CCK-8法只能在已設(shè)計好的暴露時間點，檢測DEP致HBE細胞毒性，不可反復(fù)多次測量，具有一次性。經(jīng)本文驗證，相較CCK-8法，RTCA法操作步驟簡單，不需要多次吸出培養(yǎng)液加入DEP懸液進而影響細胞狀態(tài)，保證實驗細胞質(zhì)量，組內(nèi)差異小，其次RTCA是全自動、可實時連續(xù)動態(tài)監(jiān)測，一次實驗可以得出不同暴露時間的染毒結(jié)果。之前的研究同樣表明，相對于傳統(tǒng)方法，RTCA對細胞狀態(tài)影響小，能夠更好地繼續(xù)進行其他的實驗性研究[18]。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)RTCA法也存在一些局限性，包括：①懸浮細胞無法生長在細胞培養(yǎng)板底部，由于儀器設(shè)計原理，無法檢測阻抗值的變化，只能檢測暴露前被誘導(dǎo)為貼壁細胞的懸浮免疫細胞的NCI值，但這類懸浮細胞種類極少，因此在檢測DEP致懸浮細胞活性時，更適合用CCK-8法；②RTCA不適用于氣液暴露下DEP致任何細胞毒性的檢測，RTCA無法和氣液暴露裝置聯(lián)用，因此在本研究中，實驗采用的是液液暴露的方式。由此可見，在檢測DEP致懸浮細胞毒性的研究和氣液暴露裝置聯(lián)用時，應(yīng)繼續(xù)采用傳統(tǒng)的CCK-8法。有研究表明，在藥物的細胞毒性評價方面需考慮這2種方法的適用性，CCK-8法不適合有色藥物的細胞毒性評估，RTCA不適合含電活性成分的抗癌藥物的細胞毒性評估[8]。

本實驗旨在通過RTCA和CCK-8法檢測2種DEP(SRM 1650b和SRM 2975)致HBE細胞毒性的研究，對2種方法進行比較。相對于CCK-8法，RTCA法更精準(zhǔn)地檢測DEP致HBE細胞毒性，與細胞凋亡實驗的結(jié)果有高度的一致性，因而，可用作顆粒物染毒HBE細胞后檢測細胞毒性的常規(guī)檢測方法。但RTCA在其適用范圍有更多的局限性，因此，RTCA如何檢測懸浮細胞的活性率需繼續(xù)研究。研究同時提示，輕型和重型發(fā)動機的DEP排放值得人們關(guān)注，本實驗為進一步研究DEP對肺部損傷的毒性作用機制研究提供科學(xué)依據(jù)，但SRM 1650b和SRM 2975產(chǎn)生毒性作用的能力不同，可能與顆粒物的粒徑、有機物的物質(zhì)含量和理化特性等有關(guān)，在接下來的研究中有待證實。

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