吳長(zhǎng)偉，弓新國(guó)，張 勃，李 仙，鄭 琳

（常德華馥生物技術(shù)有限公司，湖南 常德 415900）

纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等細(xì)胞壁物質(zhì)是煙梗的主要組成部分，其在卷煙燃燒熱解過(guò)程中產(chǎn)生較多低級(jí)醛類(lèi)，增加了卷煙木質(zhì)氣和刺激性，降低了煙草感官抽吸質(zhì)量［1，2］。微生物降解木質(zhì)纖維素的研究主要集中在真菌（青霉、漆斑霉、脈胞霉、白腐霉、里氏木霉、曲霉等）和細(xì)菌（纖維單胞菌、假單胞菌、芽孢桿菌等）［3-7］。然而，細(xì)菌以其適應(yīng)性強(qiáng)，分泌的酶通常具有更好的熱穩(wěn)定性以及更廣的pH耐受范圍的特性，越來(lái)越受到人們的重視［8-12］。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抗病蟲(chóng)害的作用［13-16］。目前，利用貝萊斯芽孢桿菌降解木質(zhì)纖維素的研究較少。Chen等［13］從杜仲樹(shù)皮內(nèi)分離一株芽孢桿菌157，經(jīng)16SrRNA分子生物學(xué)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，對(duì)秸稈和豆粕混合物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，纖維素降解率為9.06%，半纖維素降解率為43.61%。崔家榮等［17］從牲畜糞便中分離篩選出對(duì)檸條木質(zhì)素具有降解作用的菌株D-11，經(jīng)微生物形態(tài)學(xué)和16SrDNA鑒定為地衣芽孢桿菌（Baclicuslincheniformis），該菌株對(duì)檸條木質(zhì)素降解率為18.21%，半纖維素降解率為16.11%，纖維素降解率為13.19%。然而利用細(xì)菌降解煙草木質(zhì)纖維素的研究較少，尤其是貝萊斯芽孢桿菌降解煙梗木質(zhì)纖維素的研究少見(jiàn)報(bào)道。為此，從煙草栽培土壤中分離1株高效降解煙草細(xì)胞壁物質(zhì)的細(xì)菌HF-09，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合16SrRNA測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)該菌株鑒定，并研究HF-09降解煙梗細(xì)胞壁物質(zhì)的特性。

1 材料與方法

1.1 樣品和培養(yǎng)基

樣品：煙葉來(lái)源于云南昆明紅云紅河集團(tuán)，品種為紅大，等級(jí)為C3F；土壤來(lái)源于昆明市附近煙田。

培養(yǎng)基：①LB液體培養(yǎng)基［10］。蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L，pH 7.0；②纖維素酶篩選培養(yǎng)基［8，11］。羧甲基纖維素鈉10 g/L、酵母提取物3 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸氫二鉀3 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0；③木質(zhì)素過(guò)氧化物酶篩選培養(yǎng)基［8，11］。1%的苯胺藍(lán)母液，過(guò)濾除菌，以1%的濃度添加到LB培養(yǎng)基中，制備LB平板；④產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基［8，11］。羧甲基纖維素鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器設(shè)備

KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；PX223ZH/E型精密電子秤［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；UV-9100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；BHS-6電熱恒溫水浴鍋（群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SKY-211B大容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）；RE-5250型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀表廠）；同時(shí)蒸餾提取器（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；6890N/5973N氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS，美國(guó)安捷倫科技公司）。

1.3 纖維素降解菌株的分離和純化

稱(chēng)取采集的土壤樣品，加入適量的滅菌生理鹽水，充分振蕩，置于恒溫水浴鍋中（75℃）處理30 min。用10倍連續(xù)稀釋法進(jìn)行稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-6、10-7、10-8），菌懸液分別在LB固體培養(yǎng)基平板上劃平板，37℃靜止培養(yǎng)，3次重復(fù)。

將純化菌株接種于纖維素酶篩選培養(yǎng)基平板，于37℃培養(yǎng)12～36 h，染色（剛果紅）30 min，再用1 mol/L的NaCl溶液脫色30 min，測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑的比值（SI）。

1.4 酶活性檢測(cè)

以檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 5.5）作為溶劑，配制CMC-Na底物（1%）溶液。取100μL粗酶液與200μL底物混合，充分振蕩后，50℃水浴30 min，之后加入400μL DNS溶液（3，5-二硝基水楊酸）終止反應(yīng)，煮沸10 min，自然冷卻，加入2 mL去離子水，充分混勻，取300μL至酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm下吸光度。

1.5 纖維素降解菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn) 對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)觀察。生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［18］的方法。

1.5.2 16SrRNA序列擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析 提取細(xì)菌基因組后，用通用引物［19］（16S上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行基因擴(kuò)增。取2μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收。并通過(guò)NCBIBlast比對(duì)，從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載親緣關(guān)系較近的菌株基因序列，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Clustal W軟件比對(duì)分析，并構(gòu)建Neighbor-jioning進(jìn)化樹(shù)［13］。

1.6 煙梗纖維素降解試驗(yàn)

1.6.1 HF-09菌株生物學(xué)特性分析

1）生長(zhǎng)曲線(xiàn)。將BacillusvelezensisHF-09在LB固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度，轉(zhuǎn)接至100 mL液體LB培養(yǎng)基中（接種量1%），測(cè)定菌液最初吸光度（OD600nm），于180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)，每間隔1 h取樣，測(cè)定OD600nm（重復(fù)3次），然后繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2）耐受試驗(yàn)［8］。①溫度耐受。HF-09菌株培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，75℃水浴20 min，即為芽孢體（洗滌菌3次），取1 mL菌液到EP管中，置于不同溫度的水浴中處理20 min，自然冷卻至常溫，以芽孢體為對(duì)照樣；②pH耐受性。HF-09芽孢體制備同上述方法，取1 mL菌液到EP管中，接種到不同pH的緩沖液（pH 2～12）中，37℃水浴處理3 h。存活率=（處理后的細(xì)菌數(shù)/處理前的細(xì)菌數(shù)）×100%。

1.6.2 煙梗木質(zhì)纖維素降解效果評(píng)價(jià)

1）木質(zhì)纖維素含量檢測(cè)。經(jīng)HF-09固態(tài)發(fā)酵10 d（接總量：1%；種子菌液OD600nm=2.0）的降解煙梗（C3F）送至云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)。采用聚酯纖維濾網(wǎng)袋法測(cè)得纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，計(jì)算其降解率。降解率［8］（DR）=（接種前某成分含量-接種后某成分含量）/接種前某成分含量×100%。

2）掃描電鏡觀察。將紅大（C3F）煙梗經(jīng)HF-09固態(tài)發(fā)酵10 d的降解產(chǎn)物于50℃條件下烘干至恒重，采用掃描電鏡對(duì)其表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌株的分離和純化

通過(guò)培養(yǎng)基的富集、分離及篩選，得到12株具有降解木質(zhì)纖維素的菌株，通過(guò)對(duì)其SI、羧甲基纖維素酶（CM Case）和濾紙纖維素酶（FPAse）檢測(cè)分析，12株菌SI均大于3，其中HF-09菌株CMCase和FPAse的酶活性最高，其降解木質(zhì)纖維素的能力最強(qiáng)（圖1）。為此，選擇HF-09為出發(fā)菌株進(jìn)行研究。

對(duì)HF-09菌株進(jìn)行菌落形態(tài)特征、芽孢染色法、革蘭氏染色法鑒定（圖2）。該菌株為短桿菌，乳白色，菌落表面不規(guī)則，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，有運(yùn)動(dòng)性。

圖2 菌株HF-09的菌落形態(tài)（a）和菌體的革蘭氏染色顯微照片（b）（放大1 000倍）

2.2 16S rRNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

菌株HF-09的16SrRNA基因擴(kuò)增序列全長(zhǎng)為1 424 bp。同源性序列分析表明，HF-09的16SrRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）的同源性達(dá)93%～99%，且與已報(bào)道的Bacillus velezensis157（KY630544）和Bacillus velezensisNAU-B3（NC 022530.1）序列的同源性最高，達(dá)99%。Neighbor-jioning進(jìn)化樹(shù)（圖3）結(jié)果表明，菌株HF-09同貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于同一個(gè)分支。其中，已報(bào)道的貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis157（KY630544）是從杜仲樹(shù)皮內(nèi)分離得到的，具有明顯降解秸稈和豆粕中木質(zhì)纖維素的能力。綜合菌株形態(tài)特征觀察、生理生化特性及16SrRNA分子鑒定結(jié)果，確定木質(zhì)纖維素降解菌HF-09為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 菌株HF-09的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 煙梗纖維素降解

2.3.1 菌株HF-09的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和耐受性研究 貝萊斯芽孢桿菌HF-09在LB液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明（圖4a），7～20 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h之后達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期。pH耐受結(jié)果表明，菌株HF-09在pH 5～9區(qū)間的存活率均在94%以上；溫度耐受結(jié)果表明，菌株HF-09在75℃以下的存活率在92%以上（圖4b），表明該菌株具有良好的pH和溫度耐受性。

圖4 菌株HF-09的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（a）及對(duì)p H和溫度的耐受性（b）

2.3.2 菌株HF-09固體發(fā)酵降解紅大煙梗（C3F）中的木質(zhì)纖維素 菌株HF-09對(duì)煙梗纖維素、半纖維素和木質(zhì)素具有不同程度的降解能力，其對(duì)半纖維素的降解能力尤為顯著（圖5）。其中，菌株HF-09對(duì)纖維素的降解在最初2 d內(nèi)能力較弱（降解率為0.24%），但發(fā)酵6 d后纖維素含量由12.68%下降到10.82%（降解率為14.67%），發(fā)酵10 d后含量下降到10.04%（降解率為20.82%）；菌株HF-09對(duì)半纖維素的降解速率較為穩(wěn)定，發(fā)酵6 d后半纖維素含量由7.53%下降到5.85%（降解率為22.31%），發(fā)酵10 d后含量下降到5.25%（降解率為30.28%）；木質(zhì)素發(fā)酵6 d后，含量由6.05%下降到5.25%（降解率為13.22%），發(fā)酵10 d后含量下降到4.88%（降解率為19.34%）。結(jié)果表明，該菌分泌多種酶系，并在多種酶系的復(fù)合作用下具有明顯的降解煙梗細(xì)胞壁物質(zhì)的能力。

圖5 菌株HF-09降解煙梗木質(zhì)纖維素含量變化

2.3.3 紅大煙梗（C3F）掃描電鏡觀察 菌株HF-09對(duì)紅大煙梗（C3F）進(jìn)行固體發(fā)酵10 d，利用掃描電鏡對(duì)煙梗進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果（圖6）表明，菌株HF-09能夠在煙梗表皮組織層良好生長(zhǎng)，使原本因富含果膠、蠟質(zhì)不易被單一酶進(jìn)行分解的表皮組織層在其作用下破壞明顯，出現(xiàn)明顯的縫隙，有利于HF-09分泌的纖維素降解酶、半纖維素降解酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶等滲入到煙梗組織內(nèi)部。煙梗橫切面和縱切面電鏡顯示，煙梗組織結(jié)構(gòu)疏松，空隙增大，細(xì)胞間連接物質(zhì)和細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解明顯。

3 討論

從煙草栽培土壤中分離得到1株具有高效降解煙梗木質(zhì)纖維素的細(xì)菌HF-09，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)和16SrRNA擴(kuò)增序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。該細(xì)菌在培養(yǎng)7～20 h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在pH 5～9區(qū)間HF-09的存活率均在94%以上；在75℃以下HF-09的存活率均在92%以上。該細(xì)菌擁有生長(zhǎng)速度快和耐受性強(qiáng)的特征。同時(shí)，該菌株可以降解煙梗纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等煙梗細(xì)胞壁物質(zhì)組分，3種物質(zhì)降解率最低為19.34%，其中煙梗半纖維素的降解率達(dá)30.28%。細(xì)菌HF-09對(duì)煙梗表皮組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有明顯的分解破壞能力，表明HF-09在卷煙加工和煙草廢棄物資源利用方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，作為一種耐酸堿和分泌多種酶系的益生菌，菌株HF-09可能有利于煙草原料中還原糖轉(zhuǎn)化及產(chǎn)香物質(zhì)的衍生，對(duì)加速煙草原料醇化和品質(zhì)提升可能具有重要應(yīng)用價(jià)值。