周大旺 ， 張晨禹 ， 黎 博 ， 張 強(qiáng) ， 劉 聰 ，詹浩洪 ， 胡春林 △， 廖曉星 ，4△

（1中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院急診與災(zāi)難醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳518107；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2急診科，3衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室，廣東廣州510080；4中山大學(xué)深圳研究院，廣東深圳518057）

根據(jù)2019 年全球疾病負(fù)擔(dān)報告，在導(dǎo)致全球疾病負(fù)擔(dān)增加的疾病中，腦卒中是僅次于缺血性心臟病和糖尿病的全球性疾病［1］。腦卒中分為出血性卒中及缺血性卒中，其中以缺血性卒中為主，具有較高的致死率和致殘率［2-3］。缺血性腦損傷會引發(fā)一系列病理改變，包括興奮性毒性、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［4］。研究表明自噬及溶酶體功能在腦缺血性損傷中扮演著重要角色，不僅參與缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，還有可能作為干預(yù)、調(diào)控的切入點來影響甚至決定受損神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸［5］。轉(zhuǎn)錄因子 EB（transcription factors EB，TFEB）作為調(diào)控自噬及溶酶體功能的關(guān)鍵因子［6］，可能成為改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者預(yù)后的潛在治療靶點［7-10］。本項工作首先通過構(gòu)建不同梗死時間段永久性大腦中動脈阻塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）模型，觀察TFEB介導(dǎo)的自噬及溶酶體功能在pMCAO 模型中的改變，隨后通過敲減和過表達(dá)TFEB，觀察其對pMCAO 模型小鼠神經(jīng)功能的影響，為缺血性卒中尋找新的治療靶點。

材料和方法

1 實驗動物

60只SPF 級C57BL/6雄性小鼠，周齡8～10周，體重25～30 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0008。其中15只用于構(gòu)建不同梗阻時間pMCAO 模型，分為假手術(shù)（sham）組、梗阻2 h組、梗阻4 h組、梗阻8 h組和梗阻24 h 組，每組 3 只；另外 45 只用于注射 9 型腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus serotype 9，AAV9）及后續(xù)pMCAO 的構(gòu)建，梗阻時間為24 h，分為假手術(shù)組、TFEB過表達(dá)組（AAV9-TFEB 組）、過表達(dá)對照組（AAV9-NC 組）、TFEB敲減組（AAV9-shTFEB 組）和敲減對照組（AAV9-shNC 組），每組9 只。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于中山大學(xué)動物中心SPF 級動物房，所有實驗操作均符合中山大學(xué)動物實驗中心倫理委員會要求并按照實驗動物使用原則執(zhí)行。

2 主要儀器和試劑

腦立體定位儀（瑞沃德）；小鼠微量注射泵（深圳徠越生物技術(shù)有限公司）；小動物磁共振系統(tǒng)（Aspect M3）；組織血流掃描成像分析系統(tǒng)（PERIMED PSI-ZR）。戊巴比妥鈉購自Sigma；抗TFEB 抗體購自absin；抗 LC3B 抗體、抗 caspase-3 抗體和抗 β-actin 抗體購自CST；抗溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP-1）抗體購自Abcam；TUNEL 試劑盒購自Roche；9 型腺相關(guān)病毒購自山東維真生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 AAV9 側(cè)腦室注射 用1.0%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，根據(jù)腦立體定位儀定位，用微量注射泵將AAV9 以1 μL/min 流速注入側(cè)腦室，注射總體積10 μL，各組9 型腺相關(guān)病毒稀釋后滴度均為1×1016μg/L。

3.2 模型制備及神經(jīng)功能評分 采用栓線法制備pMACO 模型［11］，小鼠用1.0%戊巴比妥鈉麻醉后固定，沿頸正中切開，分離頸部筋膜組織，將右側(cè)頸內(nèi)動脈、頸外動脈及頸總動脈充分暴露；5-0 絲線結(jié)扎頸總動脈近心端，顯微血管夾夾閉頸外動脈，5-0 絲線牽拉頸總動脈遠(yuǎn)心端阻斷血流；于頸總動脈中部剪一小口，將頭端包被硅膠的MACO 栓線緩慢送入頸總動脈，由頸總動脈近分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動脈，向上直至大腦中動脈前端，達(dá)到阻斷大腦中動脈血流的效果，栓線進(jìn)入深度約距離頸內(nèi)、外動脈分叉處10 mm；5-0 絲線固定線栓，剪掉尾端多余部分；縫合手術(shù)切口，小鼠于37 ℃保溫毯上復(fù)蘇；采用Longa 等［11］的5 級4 分法標(biāo)準(zhǔn)對實驗動物進(jìn)行功能缺損評分：0分：正常，明顯神經(jīng)功能學(xué)損傷癥狀未見；1 分：梗阻對側(cè)前爪不能完全伸展，神經(jīng)功能缺損輕度；2分：爬行時向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)，神經(jīng)功能缺損中度；3分：爬行時向癱瘓側(cè)傾倒，神經(jīng)功能缺損重度；4分：不能自發(fā)行走，意識部分喪失。

3.3 血流灌注成像分析 采用PSI血流灌注成像系統(tǒng)進(jìn)行腦血流檢測，小鼠麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，矢狀突切開頭皮至顱骨，充分暴露整個顱骨，將激光多普勒探頭放置于顱骨正上方約10 cm處，PIMSoft 操作軟件設(shè)定參數(shù)（圖像尺寸：寬度2.2 cm，高度2.2 cm；采樣頻率：18 圖像/s；分辨率：0.040 mm；每次記錄30 s），造模前及造模后各采集1 次圖像，使用PIMSoft操作軟件進(jìn)行圖像分析處理。

3.4 MRI 成像及分析 采用Aspect 公司的1.0 T 小動物磁共振掃描儀（Aspect M3）對動物進(jìn)行冠狀位掃描。 T2WI 掃描序列參數(shù)：TR/TE 7663.294 ms/76.67 ms，層厚 1.0 mm，層間距 0.1 mm，Hor.FOV 28 mm，Vent.FOV 28 mm，翻轉(zhuǎn)角 90°，矩陣192×192，激勵次數(shù)12；掃描完成后導(dǎo)出圖像用Image J軟件進(jìn)行分析。

3.5 取材、免疫熒光、尼氏染色和TUNEL 染色 pMACO 模型后24 h 過量麻醉處死動物，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水快速灌注，然后用4%多聚甲醛灌注固定，OTC 包埋。根據(jù) The Mouse Brain（Paxinos-Watson）圖譜選取冠狀位層面進(jìn)行冰凍切片，層厚30 μm。將切片脫OTC、洗滌和通透后按DAPI、尼氏染色及TUNEL染色的具體操作步驟均按照相關(guān)試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。選取皮層梗死半暗帶區(qū)進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞計數(shù)，每個標(biāo)本選取200×倍鏡下5 個不同視野進(jìn)行計數(shù)。

3.6 Western blot 提取皮層組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度后與5×loading buffer 混合變性，每孔取 20 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，TBST 溶液清洗后，加入 5% BSA 溶液室溫下封閉 1 h，TBST 溶液清洗3 次后，加入Ⅰ抗（TFEB、LAMP-1、caspase-3和 LC3-Ⅱ抗體1∶1 000 稀釋，β-actin 抗體 1∶2 000 稀釋），于4 ℃搖床中孵育過夜，加TBST 振洗后加入HRP 標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗（稀釋倍數(shù)1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以ImageJ 軟件分析計算各組蛋白的相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件分析。計量資料表示方法為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩組間數(shù)據(jù)分析采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦組織血流灌注

PeriCam PSI 血流灌注量可用灌注量單位（PU）表示。結(jié)果顯示pMCAO 前左右兩側(cè)血流分布對稱，pMCAO 后梗死側(cè)相應(yīng)區(qū)域血流灌注量顯著下降（P＜0.01），圖像顏色由紅色變?yōu)榈S色甚至藍(lán)色，說明造模成功，并以此為標(biāo)準(zhǔn)，造模成功小鼠納入組別進(jìn)行后續(xù)分析，見圖1。

Figure 1.The blood perfusion in the brain significantly decreased after pMCAO.The scale bar=1 cm.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs baseline.圖1 pMCAO后梗死側(cè)血流灌注顯著下降

2 相關(guān)蛋白表達(dá)水平隨pMCAO時間延長改變

隨著pMCAO 梗死時間的延長，TFEB 與LAMP-1的蛋白表達(dá)量都隨之下降，各梗死時間段下降幅度均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），且在p-MCAO-24 h 組差異最大，自噬體膜型LC3B-Ⅱ在各梗死時間段均有下降趨勢（P＜0.05），各組Pro-caspase-3 與cleaved caspase-3 表達(dá)均升高（P＜0.05），caspase-3 活化比例在各組均有上升趨勢，在pMCAO-8 h 組較假手術(shù)組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The time-dependent changes of TFEB，LAMP-1，LC3B and caspase-3 levels from 2 h to 24 h after pMCAO.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs sham group.圖2 皮層神經(jīng)元TFEB、LAMP-1、LC3B和caspase-3蛋白在不同pMCAO梗阻時間的表達(dá)情況

3 側(cè)腦室注射AAV9 能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因至皮層神經(jīng)元，增加或抑制TFEB的表達(dá)

免疫熒光顯示各組皮層神經(jīng)元內(nèi)GFP 熒光明亮，越靠近腦室區(qū)越明顯（圖3A）；Western blot 結(jié)果顯示AAV9-TFEB 組TFEB 總體表達(dá)增高、入核增多（P＜0.05），而AAV9-shTFEB 組TFEB 表達(dá)減少、入核顯著減少（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.Overexpression or knockdown of TFEB introduced by AAV9.A：the cortical neurons infected by AAV9（scale bar=100 μm）；B：nuclear and cytoplasmic expression of TFEB in the brain tissue.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs AAV9-NC group.圖3 經(jīng)AAV9介導(dǎo)的腦組織過表達(dá)或敲減TFEB的效果

4 各組神經(jīng)功能學(xué)評分及MRI梗死情況

AAV9-TFEB 組神經(jīng)功能缺損評分為2.11±0.78，低 于 AAV9-NC 組 的 3.00±0.70（P＜0.05）；AAV9-shTFEB 組神經(jīng)功能缺損評分為3.67±0.50，高于 AAV9-shNC 組的 3.0±0.50（P＜0.05）。MRI 結(jié)果顯示與 AAV9-NC 組（0.73±0.11）相比，AAV9-TFEB 組的梗死區(qū)域體積比（0.51±0.14）顯著減少（P＜0.01）。AAV9-shTFEB 組（0.89±0.06）與AAV9-shNC 組（0.76±0.12）相比梗死區(qū)域體積比增大（P＜0.01）。見圖4。

Figure 4.The effects of overexpression or knockdown of TFEB on neurologic score and infarct volume after pMCAO.A：TFEB overexpression reduced neurologic deficit score；B：TFEB overexpression reduced infarct volume；C：knockdown of TFEB aggravated neurologic deficit score；D：knockdown of TFEB increased infarct size.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs AAV9-NC group；#P＜0.05 vs AAV9-shNC group.圖4 過表達(dá)或敲減TFEB對小鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積的影響

5 細(xì)胞存活情況及凋亡情況

尼氏染色結(jié)果顯示綠色箭頭為正常神經(jīng)元，神經(jīng)元排列規(guī)律，整體藍(lán)染，尼氏小體呈深藍(lán)色粗大緊密的顆粒。紅色箭頭為變性、壞死神經(jīng)元，神經(jīng)元排列紊亂，尼氏小體減少，甚至消失，整體呈淡染狀態(tài)。AAV9-TFEB 組缺血半暗帶區(qū)正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)為104.80±1.58，顯著多于 AAV9-NC 組的 69.17±2.40（P＜0.01）；AAV9-shTFEB 組缺血半暗帶區(qū)正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)為51.33±2.45，顯著少于AAV9-shNC 組的71.50±2.23（P＜0.01），見圖 5。TUNEL 檢測結(jié)果顯示AAV9-TFEB 組缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡率為（5.74±0.16）%，顯著少于 AAV9-NC 組的（13.00±0.28）%（P＜0.01）；AAV9-shTFEB 組缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡率為（21.40±0.34）%，顯著高于AAV9-shNC組的（12.83±0.53）%（P＜0.01），見圖6。

Figure 5.The results of Nissl staining.The green arrow points to normal neurons，while the red arrow points to damaged neurons.The scale bar=50 μm.A：TFEB overexpression；B：TFEB knockdown.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs AAV9-NC group；##P＜0.01 vs AAV9-shNC group.圖5 皮層尼氏染色結(jié)果

Figure 7.The protein levels of TFEB，LAMP-1，LC3B and cleaved caspase-3 in cortical neurons with TFEB overexpression were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs AAV9-NC group.圖7 TFEB過表達(dá)對pMCAO后皮層神經(jīng)元TFEB、LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Figure 8.The protein levels of TFEB，LAMP-1，LC3B and cleaved caspase-3 in cortical neurons with TFEB knockdown were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs AAV9-shNC group.圖8 敲減TFEB對pMCAO后皮層神經(jīng)元TFEB、LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

6 過表達(dá)及敲減TFEB對pMCAO后皮層神經(jīng)元細(xì)胞LAMP-1、LC3B和cleaved caspase-3表達(dá)的影響

AAV9-TFEB 轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元后促進(jìn)TFEB 的表達(dá)（P＜0.05）。AAV9-TFEB 轉(zhuǎn)染使pMCAO 后皮層神經(jīng)元細(xì)胞自噬和溶酶體功能增強(qiáng)（LC3B-Ⅱ及LAMP-1 表達(dá)增多），并使cleaved caspase-3 活化比例顯著減少（P＜0.05），見圖7。AAV9-shTFEB 轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元后降低TFEB 的表達(dá)（P＜0.05）。AAV9-shTFEB 轉(zhuǎn)染使pMCAO 后皮層神經(jīng)元細(xì)胞自噬和溶酶體功能進(jìn)一步減弱（LC3B-Ⅱ及LAMP-1 蛋白表達(dá)減少），并使 cleaved caspase-3 活化比例顯著增高（P＜0.05），見圖8。

討 論

腦卒中以缺血性卒中為主，目前除了溶栓與取栓，仍然沒有特別有效的治療手段，并且溶栓與取栓受時間窗限制也難以使絕大部分患者受益。因此，充分認(rèn)識缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制并做相應(yīng)干預(yù)對缺血性卒中的治療至關(guān)重要。缺血性卒中后神經(jīng)元死亡的機(jī)制十分復(fù)雜，在腦梗死中央?yún)^(qū)絕大部分神經(jīng)元發(fā)生急性壞死，而在缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元則發(fā)生程序性壞死、凋亡和自噬等，其中自噬與凋亡是左右缺血性損傷后神經(jīng)元預(yù)后的主要方式。自噬是一個高度依賴溶酶體功能的分解代謝過程，它在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，如果自噬功能障礙，則可能引起感染、癌癥、神經(jīng)退行性變、心血管疾病和衰老等疾病的發(fā)生與發(fā)展。自噬對細(xì)胞的存活具有雙向作用［12］，在缺血性損傷中，適度的自噬具有保護(hù)作用［13-14］，而自噬的過度激活則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］，因此，在腦缺血過程中充分認(rèn)識自噬的變化并調(diào)控自噬及溶酶體功能或許能成為治療缺血性腦卒中的一個重要切入點。Caspase 家族是腦缺血損傷后神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)節(jié)器，在腦缺血損傷中caspase 家族明顯被活化，。在眾多的caspase 家族成員中，caspase-3是細(xì)胞凋亡主要的參與者，在缺血性腦損傷中caspase-3 明顯升高［16］。因此，抑制 caspase-3 的活化也是減少缺血性腦損傷的關(guān)鍵所在。

TFEB 是調(diào)節(jié)自噬及溶酶體功能的重要因子，它是小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子/轉(zhuǎn)錄因子E（microphthalmia-associated transcription factor/transcription factor E，MiTF/TFE）家族成員，通過同源或異源二聚體的形式與DNA 結(jié)合，識別啟動子E-box、M-box 啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮調(diào)控作用。TFEB 作用廣泛，可參與多種疾病的病理生理過程，已經(jīng)被認(rèn)為是改善腎臟疾病、神經(jīng)元退行性病變和動脈粥樣硬化等疾病的潛在靶點［17-19］。本研究結(jié)果顯示在小鼠pMCAO模型中隨著梗阻時間的延長，梗死側(cè)皮層神經(jīng)元TFEB 表達(dá)逐漸下降，并伴隨著自噬及溶酶體功能障礙、凋亡關(guān)鍵執(zhí)行分子caspase-3活化增加，表明自噬及溶酶體途徑的確參與缺血性神經(jīng)元損傷的發(fā)生發(fā)展。我們后續(xù)利用AAV9 過表達(dá)皮層神經(jīng)元TFEB可使小鼠pMCAO 后腦梗死體積縮小、神經(jīng)功能改善，主要機(jī)制是TFEB 過表達(dá)恢復(fù)了pMCAO 后自噬及溶酶體功能，增強(qiáng)了對受損細(xì)胞器及有害大分子的清除，減少了caspase-3的活化，從而減輕了神經(jīng)元凋亡，減輕了神經(jīng)元損傷。我們通過敲減皮層神經(jīng)元TFEB進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示TFEB敲減后自噬及溶酶體功能障礙加重，caspase-3 活化增加，小鼠神經(jīng)功能缺損愈加嚴(yán)重，腦梗死體積比也均顯著增加，與TFEB過表達(dá)組結(jié)果相比呈相反趨勢。

綜上所述，TFEB 調(diào)控的自噬及溶酶體功能參與了小鼠缺血性卒中神經(jīng)元損傷的發(fā)生發(fā)展，過表達(dá)皮層神經(jīng)元TFEB 可通過激活自噬及溶酶體功能減輕缺血性卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。