甘肅省部分地區(qū)羔羊死亡病原調(diào)查

高生智，潘永紅*，梁 斌，詹 芳，史萬(wàn)貴，李有全

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730030）

2019—2020年甘肅省部分地區(qū)的羊只出現(xiàn)了以貧血、高熱、消瘦、出血和體表淋巴結(jié)腫大為主要特征的臨床癥狀，呈點(diǎn)狀散發(fā)，屬地方性動(dòng)物疫病，初步懷疑為羊泰勒蟲(chóng)病。為進(jìn)一步了解臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣等地區(qū)羊泰勒蟲(chóng)病病原感染情況，于2020年3—5月對(duì)以上4個(gè)縣患病羊只進(jìn)行了羊耳尖血涂片，并采集羊血液，一一對(duì)應(yīng)編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血液涂片染色鏡檢和羊泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)。對(duì)鏡檢有典型蟲(chóng)體、有疑似蟲(chóng)體和部分鏡檢陰性血液涂片對(duì)應(yīng)的全血樣品進(jìn)行羊泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：永靖縣、榆中縣、臨潭縣的羊泰勒蟲(chóng)病是呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)的混合感染，而華池縣羊泰勒蟲(chóng)病是單一的尤氏泰勒蟲(chóng)感染，證實(shí)了臨床懷疑診斷?，F(xiàn)將試驗(yàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血片 來(lái)自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90張。于羊耳尖采血推制血片，自然風(fēng)干，甲醇固定，吉姆薩染色。

1.1.2 全血 來(lái)自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90份。于羊頸靜脈采血，搖勻，帶回實(shí)驗(yàn)室凍存待檢。

1.1.3 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司，批號(hào)20200618。

1.1.4 普通PCR試劑 引物兩對(duì)，尤氏引物、呂氏引物；DNA聚合酶（premix Tap），DEPC水，dNTP，標(biāo)準(zhǔn)DNA（Marker），上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，常規(guī)電泳液。

1.1.5 移液器和槍頭 2 μl、10 μl、50 μl、100 μl、200 μl、1 000 μl單道移液器，高壓滅菌配套槍頭。

1.1.6 其他 顯微鏡、生物安全柜、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 血片 常規(guī)顯微鏡鏡檢。鏡檢20高倍以上野，發(fā)現(xiàn)5個(gè)以上典型蟲(chóng)體為有典型蟲(chóng)體；發(fā)現(xiàn)1～2個(gè)疑似蟲(chóng)體為有疑似蟲(chóng)體；未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體為無(wú)蟲(chóng)。

1.2.2 全血 按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA模板，普通PCR鑒定。

試驗(yàn)成立：電泳結(jié)束后，陽(yáng)性對(duì)照樣品應(yīng)出現(xiàn)2條帶，分別為303 bp和530 bp。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。

陽(yáng)性判定：如果待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物在303 bp和（或）530 bp處出現(xiàn)條帶，則為陽(yáng)性。如出現(xiàn)2條帶，則判定該待檢樣品為兩種泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性；如出現(xiàn)1條帶，則判定該待檢樣品為相對(duì)應(yīng)的泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性。

陰性判定：如待檢樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 血片

如表1所示，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)地區(qū)患病羊只的蟲(chóng)體檢出率不同，臨潭縣最高，為68.42%，華池縣最低，為36.67%。

表1 4個(gè)地區(qū)蟲(chóng)體檢出結(jié)果

2.2 全血

如表2所示，4個(gè)地區(qū)患病羊只蟲(chóng)體感染率不同，除華池縣以外，其余3個(gè)縣的患病羊只都同時(shí)感染2種泰勒蟲(chóng)。

表2 4個(gè)地區(qū)樣本泰勒蟲(chóng)PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 血片對(duì)應(yīng)全血

從表3中可以看出，鏡檢有蟲(chóng)、PCR確認(rèn)有泰勒蟲(chóng)的比例為45.90%（56/122），鏡檢有蟲(chóng)、PCR確認(rèn)無(wú)泰勒蟲(chóng)的比例為16.39%（20/122），鏡檢無(wú)蟲(chóng)、PCR確認(rèn)有泰勒蟲(chóng)的比例為27.87%（34/122），鏡檢無(wú)蟲(chóng)、PCR確認(rèn)無(wú)泰勒蟲(chóng)的比例為9.84%（12/122），鏡檢與PCR結(jié)果一致率為55.74%（68/122），鏡檢與PCR結(jié)果不一致率為44.26%（54/122）。

表3 4個(gè)地區(qū)樣本泰勒蟲(chóng)鏡檢結(jié)果 單位：個(gè)

3 分析與討論

在華池縣檢測(cè)到尤氏泰勒蟲(chóng)，在榆中縣、永靖縣、臨潭縣檢測(cè)到呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)，確認(rèn)了榆中縣、永靖縣、臨潭縣羊泰勒蟲(chóng)病是呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)的混合感染；華池縣羊泰勒蟲(chóng)病是單一的尤氏泰勒蟲(chóng)感染。調(diào)查4縣平均陽(yáng)性率為44.95%，優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為尤氏泰勒蟲(chóng)，其次是呂氏泰勒蟲(chóng)。

羊泰勒蟲(chóng)病在甘肅分布廣泛[1-4]，各地感染率、發(fā)病率、死亡率存在明顯差異。此次鏡檢平均陽(yáng)性率為62.3%（76/122），PCR平均陽(yáng)性率為73.77%（90/122），鏡檢與PCR結(jié)果一致率為55.74%（68/122）。

在羊泰勒蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查中，長(zhǎng)期沿用采血涂片染色鏡檢的方法是急性發(fā)病病例確診的經(jīng)典方法[1-4]，但在大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查時(shí)稍顯不足，尤其是紅細(xì)胞染蟲(chóng)率偏低時(shí)易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，血液涂片染色檢查要求操作人員熟練掌握制片技術(shù)，熟悉羊泰勒蟲(chóng)、無(wú)漿體的蟲(chóng)體形態(tài)和大小，否則當(dāng)出現(xiàn)混合感染時(shí)易造成誤檢漏檢。此次4縣鏡檢誤差率為44.26%（54/122）。

國(guó)外報(bào)道的羊泰勒蟲(chóng)有4個(gè)種，即萊氏泰勒蟲(chóng)、綿羊泰勒蟲(chóng)、分離泰勒蟲(chóng)和隱藏泰勒蟲(chóng)，其中萊氏泰勒蟲(chóng)具有致病性，由其引起的泰勒蟲(chóng)病也稱(chēng)惡性泰勒蟲(chóng)病。自1958年我國(guó)四川甘孜藏族自治州報(bào)道該病以來(lái)，甘肅、青海、寧夏、陜西、遼寧、內(nèi)蒙古陸續(xù)報(bào)道有該病發(fā)生[5-7]。殷宏等（2002）通過(guò)系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，我國(guó)羊泰勒蟲(chóng)病的病原并非萊氏泰勒蟲(chóng)，而是呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)。同時(shí)證實(shí)甘肅省夏河縣、寧縣、天?？h羊的泰勒蟲(chóng)是單一的呂氏泰勒蟲(chóng)，在臨潭縣、張家川縣及青海省湟源縣的羊泰勒蟲(chóng)是呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)的混合[5]。筆者再次證實(shí)了永靖縣、榆中縣、臨潭縣羊泰勒蟲(chóng)是呂氏泰勒蟲(chóng)和尤氏泰勒蟲(chóng)的混合；華池縣羊泰勒蟲(chóng)是尤氏泰勒蟲(chóng)，從而得知甘肅省羊泰勒蟲(chóng)病的病原是尤氏泰勒蟲(chóng)和呂氏泰勒蟲(chóng)。