歐夏妙 鐘全強(qiáng) 唐景財(cái) 吳洪文

【摘要】 目的 研究厄貝沙坦聯(lián)合表柔比星對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用及對生存素（survivin）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的影響。

方法 采用MTT（噻唑藍(lán)）法檢測不同劑量表柔比星及厄貝沙坦聯(lián)合表柔比星對乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，用ELISA法（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測空白對照組、表柔比星組（0.75 μg/mL）、表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦組（0.75 μg/mL+2.3 μg/mL）、順鉑陽性對照組（5 μg/mL）各組藥物作用下細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF及survivin的表達(dá)水平。

結(jié)果 表柔比星對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.75 μg/mL，厄貝沙坦聯(lián)合表柔比星對細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且隨著濃度的增加而增強(qiáng)，三個(gè)劑量組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。聯(lián)合用藥組與單用表柔比星組及陽性對照組分別作用24 h、48 h、72 h后與對照組比較VEGF的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦組中survivin表達(dá)水平與空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），作用72 h后聯(lián)合用藥組與陽性對照組相比較，survivin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），聯(lián)合用藥組作用48 h、72 h和表柔比星組比較survivin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

結(jié)論 厄貝沙坦聯(lián)合表柔比星對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，可以下調(diào)survivin的表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】 厄貝沙坦;表柔比星;乳腺癌MCF-7細(xì)胞;抑制作用

中圖分類號：R737.9 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.05.002

【Abstract】 Objective To study the inhibition effect of irbesartan combined with epirubicin on proliferation of breast cancer cells and its influence on the expressions of survivin and vascular endothelial growth factor （VEGF）.

Methods MTT （Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide） method was used to detect the inhibition rate of different dose of epirubicin and irbesartan combined with epirubicin on MCF-7 cells of breast cancer after action of drugs for 24 h， 48 h and 72 h， respectively. ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） was used to detect the expression levels of survivin and VEGF in cell culture medium under the action of drugs among blank control group， epirubicin group （0.75 μg/mL）， epirubicin combined with irbesartan group （0.75 μg/mL + 2.3 μg/mL） and cisplatin positive control group （5 μg/mL）.

Results The inhibitory concentration 50% （IC50） of epirubicin on MCF-7 cells of breast cancer was 0.75 μg/mL， irbesartan combined with epirubicin had a significant inhibitory effect on cell proliferation， which increased with the increase of concentration， and difference between the three dose groups and the blank control group was statistically significant （P < 0.05 or 0.01）. After action of drugs for 24 h， 48 h and 72 h， difference of VEGF expression levels between the epirubicin group， the cisplatin positive control group and the blank control group was not statistically significant （P > 0.05）. Difference of the expression levels of survivin between the epirubicin combined with irbesartan group and the blank control group was statistically significant （P < 0.05）. After action of drugs for 72 h， difference of the expression levels of survivin between the combined medication group and the blank control group was statistically significant （P < 0.01）. And action of drugs for 48 h and 72 h， difference of the expression levels of survivin between the combined medication group and the epirubicin group was statistically significant （P < 0.01）.

Conclusion Irbesartan combined with epirubicin can significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells of breast cancer and down-regulate the expression level of survivin.

【Key words】 ?irbesartan; epirubicin; MCF-7 cells of breast cancer; inhibitory effect

生存素（survivin）是目前研究發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞凋亡抑制因子中功能最強(qiáng)的，屬于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的新成員，survivin通過有絲分裂對細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能[1]，survivin基因在腫瘤的形成、進(jìn)展過程中對細(xì)胞周期起正性調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)了腫瘤的生長[2]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中血管生長的重要因子之一[3]。許多腫瘤細(xì)胞組織中VEGF呈高表達(dá)[4]。本課題前期研究表明：厄貝沙坦對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，可以下調(diào)VEGF的表達(dá)水平[3]。此次研究進(jìn)一步探討厄貝沙坦聯(lián)合表柔比星對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用及對VEGF和survivin表達(dá)的影響，進(jìn)一步為臨床抗腫瘤靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;厄貝沙坦購自浙江華海藥業(yè)股份有限公司;胎牛血清、胰島素和DMEM培養(yǎng)基均購自杭州四季青生物工程公司：DMEM加1.0 mM丙酮酸鈉，0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氫鈉，添加0.01 mg/mL胰島素和10%胎牛血清。VEGF試劑盒、survivin試劑盒和ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定法）試劑盒均購自江蘇凱基生物科技有限公司（2～8℃保存）。

1.1.2 試驗(yàn)細(xì)胞

乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫（試驗(yàn)前，細(xì)胞保存于液氮罐中）。

1.1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），MODEL550酶標(biāo)儀（美國BIORAD公司），CO2培養(yǎng)箱（美國thermo forma公司）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

該研究中的MCF-7細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃，0.5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，胰酶消化后的細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行種板，細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，將96孔板中腫瘤細(xì)胞密度調(diào)至約5000個(gè)/孔。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

分別設(shè)置表柔比星高劑量組、中劑量組、低劑量組三個(gè)組及空白對照組，表柔比星給藥劑量分別為1.2 μg/mL、0.6 μg/mL、0.3 μg/mL，空白對照組給藥濃度為0 μg/mL[5];另外，分別設(shè)置表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦高劑量組、中劑量組、低劑量組三個(gè)組及空白對照組，表柔比星+厄貝沙坦給藥劑量分別為（1.2+2.4） μg/mL、（0.6+1.2） μg/mL、（0.3+0.6） μg/mL，空白對照組給藥濃度為0 μg/mL。MTT法測定表柔比星及表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響：在表柔比星高劑量組、中劑量組、低劑量組三個(gè)組對乳腺癌細(xì)胞作用24 h、48 h、72 h后測抑制率，運(yùn)用MTT法檢測表柔比星三個(gè)劑量組干預(yù)后，用酶標(biāo)儀以570 nm/630 nm雙波長測定各組細(xì)胞吸光度（A）值，細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值）×100%。重復(fù)上述試驗(yàn)3次，Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。根據(jù)IC50值設(shè)定后續(xù)試驗(yàn)的作用濃度[5]。

1.2.3 采用ELISA方法檢測各組中VEGF及survivin的表達(dá)

試驗(yàn)分為空白對照組、表柔比星組（0.75 μg/mL）、表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦組（0.75 μg/mL+2.3 μg/mL）、順鉑陽性對照組（5 μg/mL），以未給藥物培養(yǎng)液作為空白對照組。采用雙抗夾心法分別測定各組藥物作用下細(xì)胞培養(yǎng)基中VEGF及survivin表達(dá)水平，檢測步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟實(shí)行，在450 nm波長下測量樣本的吸光度值（A），測定的最小值為20 pg/mL，VEFG及survivin的含量均按照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算得到。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（±s）表示，各實(shí)驗(yàn)組間比較采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，進(jìn)一步比較采用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) ?果

2.1 MTT法的測定結(jié)果

經(jīng)系統(tǒng)軟件計(jì)算，表柔比星對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.75 μg/mL，在相同作用時(shí)間下，隨著表柔比星給藥濃度的增加，其對MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)（P<0.05），在高、中、低三個(gè)劑量組和聯(lián)合用藥三個(gè)劑量組中，隨著用藥時(shí)間的延長，其對MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)（P<0.05）。見表1、表2。

2.2 ELISA方法測定各組中VEGF及survivin的表達(dá)結(jié)果

從表3對VEGF表達(dá)水平測定結(jié)果可以看出：表柔比星組、聯(lián)合用藥組和順鉑陽性對照組分別作用24 h、48 h、72 h后比較VEGF表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。從表4對survivin表達(dá)水平的測定可以看出：聯(lián)合用藥組作用72 h與陽性對照組作用72 h相比較，survivin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），聯(lián)合用藥組作用48 h、72 h和表柔比星組比較，survivin的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討 ?論

國外研究表明survivin在大多數(shù)乳腺癌中呈過度表達(dá)，而VEGF在胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，這一過程導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生[2]。CHEN等[4]相關(guān)學(xué)者對survivin和VEGF因子與腫瘤相關(guān)的研究報(bào)道指出，survivin是血管生成過程中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的一種新的生長因子誘導(dǎo)保護(hù)基因，VEGF通過PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)survivin表達(dá)。結(jié)果顯示survivin和VEGF在SCLC（小細(xì)胞肺癌）中的表達(dá)呈正相關(guān)，survivin和VEGF的過度表達(dá)可能在SCLC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并可作為判斷腫瘤預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。

國外相關(guān)研究[5～8]認(rèn)為survivin在腫瘤中大量表達(dá)，與許多人類腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。這種凋亡抑制劑在促進(jìn)癌細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡中都有相關(guān)作用。因此，異常survivin表達(dá)刺激腫瘤進(jìn)展，并對多種腫瘤的幾種治療策略產(chǎn)生抵抗[9～11]。有效下調(diào)survivin或抑制導(dǎo)致自發(fā)凋亡或?qū)熀头暖熋舾衃12～13]。因此，所有這些特征使survivin成為一個(gè)有吸引力的癌癥治療靶點(diǎn)[14～16]。

本次研究針對survivin和VEGF這兩種表達(dá)因子進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究，結(jié)果表明：表柔比星高、中、低三個(gè)給藥劑量組對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，在ELISA方法測定各組結(jié)果中顯示：隨著給藥時(shí)間的延長，表柔比星組、聯(lián)合用藥組與空白對照組對比較，survivin的表達(dá)均具有顯著差異，其中，聯(lián)合用藥組作用72 h與陽性對照組作用72 h相比較，survivin的表達(dá)有顯著差異，而且對survivin因子的下調(diào)作用隨著作用時(shí)間的延長而增加，從單組數(shù)據(jù)分析，聯(lián)合用藥組可以下調(diào)VEGF表達(dá)，但對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，用藥后24 h、48 h、72 h比較，VEGF的表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可能與培養(yǎng)細(xì)胞過程中樣本量較小有關(guān)，在后續(xù)研究中可以加大樣本數(shù)量，優(yōu)化和完善試驗(yàn)條件，對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

據(jù)本次研究結(jié)果推測，厄貝沙坦對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用可能與下調(diào)VEGF因子[3]及survivin因子作用機(jī)制有關(guān)，本次研究結(jié)果也表明：聯(lián)合用藥組（表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦）與單用表柔比星組分別作用24 h、48 h、72 h對survivin表達(dá)作用差異顯著，這一結(jié)果提示：表柔比星聯(lián)合厄貝沙坦對降低化療藥的給藥劑量，減輕化療藥物毒性具有潛在可能，同時(shí)也可能減少治療過程中腫瘤細(xì)胞的耐藥性，還可能為新的聯(lián)合化療方案提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-10-30 修回日期：2021-04-23）

（編輯：潘明志）