尤斯涵 郭春燕

河北北方學(xué)院藥學(xué)系，張家口，075000，中國(guó)

乳腺癌（breast cancer，BC）是指發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，易受環(huán)境和遺傳因素的影響［1］。盡管目前有了很多治療BC 的方法，比如放射治療和手術(shù)、激素阻斷劑的給藥、化學(xué)療法和單克隆抗體，但是仍有許多患者在治療后出現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)等不良結(jié)果［2］。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一種存在于新生兒臍帶組織中的多功能干細(xì)胞［3］。UC-MSCs 具有易于獲得、擴(kuò)增等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)［4］；由于UC-MSCs 的表面抗原不突出，對(duì)移植細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)不明顯，配型要求不嚴(yán)格，便于移植［5-6］。至今，已有多項(xiàng)試驗(yàn)評(píng)估了UC-MSCs 治療惡性腫瘤（malignant tumor）的療效，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［7-8］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在研究靶點(diǎn)、藥物、疾病和通路之間復(fù)雜多變的關(guān)系，為藥物發(fā)現(xiàn)提供了一種新方法［9］。目前，生物信息學(xué)已成為通過(guò)處理大量原始數(shù)據(jù)來(lái)研究系統(tǒng)特性的新工具。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法不僅幫助我們獲取治療疾病的差異基因，還能給出與疾病相關(guān)的生物學(xué)通路等信息?；诖朔N背景，本研究將通過(guò)采用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法對(duì)所選臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究UC-MSCs 治療BC 的核心靶點(diǎn)及差異基因，初步探索它們的作用與功能，希望能為治療BC 提供新的方向。

1 UC-MSCs 治療BC 的材料與方法

1.1 材料

進(jìn)入NCBI（www.ncbi.com.cn）選擇GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)以“Human umbilical cord”、“Homo sapiens”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到了Naomi Ohta 等［10］提供的芯片數(shù)據(jù)GSE64827，下載UC-MSCs 細(xì)胞治療的原始數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 差異基因的獲取

通過(guò)檢索Pubmed、Embase、Cochrane Library 和Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索UC-MSCs 抑制和促進(jìn)腫瘤的文獻(xiàn)。進(jìn)入 NCBI（www.ncbi.com.cn）的首頁(yè)界面，選擇 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term=）進(jìn)行搜索。依據(jù)參考文獻(xiàn)與病例信息，利用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)置芯片數(shù)據(jù)，下載UC-MSCs 細(xì)胞治療的原始數(shù)據(jù)。

通過(guò)使用R 軟件對(duì)所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行R 算法的原始數(shù)據(jù)處理分析（四分位數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理）。即將數(shù)據(jù)中的探針I(yè)D 轉(zhuǎn)換為基因名，通過(guò)R 軟件進(jìn)行跑圖，得到UC-MSCs 細(xì)胞治療前后的差異基因，并將所得的結(jié)果以火山圖的形式展現(xiàn)出來(lái)。

1.2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)［11］中找出這些差異基因的相關(guān)基因并進(jìn)行整理，從中選取置信度值在0.7 以上（包含0.7）的差異基因及相關(guān)基因。利用Cytoscape3.2.1軟件進(jìn)行渲染作圖分析，做出篩選差異基因及其相關(guān)基因的相互作用關(guān)系。運(yùn)用Cytoscape3.2.1 軟件中“Network Analyzer”得出平均自由度以及最大自由度值，對(duì)篩選的差異基因及其相關(guān)基因相互作用進(jìn)行拓?fù)浜Y選得到其PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 GO 和KEGG 分析

利用生信分析檢索引擎DAVID［12］（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）和R 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的差異基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析。

2 結(jié)果

2.1 獲得的差異基因

Naomi Ohta 等提供的芯片數(shù)據(jù)GSE64827 中一共含有6 個(gè)樣本，其中有3 例是UC-MSCs 的對(duì)照樣本，剩余的3 例是UC-MSCs 與乳腺癌細(xì)胞（MDA-231 細(xì)胞）共培養(yǎng)的樣本。利用R 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)信息標(biāo)準(zhǔn)化處理（Fig.1），通過(guò)分析得到了11 個(gè)上調(diào)的差異基因（Tab.1），并繪制出火山圖（Fig.2）。

Fig.2 Volcano plot of differential genes

Tab.1 Differential genes

Fig.1 Data GSE64827 sample normalization correction

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

在基因蛋白-基因蛋白相互作用中，選取置信度大于等于 0.7 的基因并通過(guò)Cytoscape3.2.1 軟件對(duì)11 個(gè)差異基因及其相關(guān)基因的相互作用關(guān)系作圖（Fig.3），得到與10 個(gè)差異基因相互作用的基因有68 個(gè)，通過(guò)274條邊進(jìn)行相互作用。在Cytoscape3.2.1 軟件“Network Analyzer”得出平均自由度7.026 以及最大自由度19，對(duì)Fig.3 進(jìn)行拓?fù)浜Y選得到其PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（Fig.4），得出42 個(gè)節(jié)點(diǎn)基因，并通過(guò)179 條邊進(jìn)行相互作用，其中顏色由紅到黃代表重要程度依次降低。經(jīng)拓?fù)浜Y選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)度高（基因間相互作用多）的差異基因（Tab.2）。

Tab.2 Four differential genes with high correlation in the post-topology PPI network

Fig.3 Interaction relationship between 11 differential genes and their related genes

Fig.4 10 differential genes and their related genes PPI network（topology）

2.3 GO 功能富集結(jié)果

通過(guò)DAVID 在線分析工具和R 軟件得出GO 功能的富集分析結(jié)果（Fig.5），其中GO 分析注釋得到了3 條生物過(guò)程，分別是果糖代謝過(guò)程、糖酵解過(guò)程和缺氧反應(yīng)過(guò)程。GO 分析涉及的主要基因?yàn)镻FKFB4、ALDOC、DDIT4、CA9。

Fig.5 GO enrichment analysis

2.4 KEGG 通路分析結(jié)果

利用DAVID 在線分析工具和R 語(yǔ)言軟件得出KEGG 通路圖（Fig.6），從Fig.6B 中可以看出，紅色區(qū)域（3.1.3.46 和4.1.2.13）可能含有11 個(gè)差異基因。進(jìn)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得出3.1.3.46 中含有差異基因醛縮酶C（aldolase fructose-bisphosphate C，ALDOC），4.1.2.13 中含有差異基因PFKFB4。對(duì)11 個(gè)差異基因進(jìn)行R 分析，將得出的KEGG 通路結(jié)果數(shù)據(jù)做氣泡圖（Fig.7）。從Fig.7 中可以看出其只出現(xiàn)了一條通路，即果糖和甘露糖代謝。

Fig.6 KEGG pathway analysis

Fig.7 The bubble chart of KEGG pathway

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠通過(guò)大數(shù)據(jù)集來(lái)分析預(yù)測(cè)活性生物物質(zhì)的可能機(jī)制，從而確定藥物在癌癥等疾病治療中的效應(yīng)。生物信息學(xué)是生物研究的最新領(lǐng)域之一，主要通過(guò)使用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)和計(jì)算等方法來(lái)處理和分析生物數(shù)據(jù)。因此本文利用這兩種方法來(lái)研究UC-MSCs治療BC 的核心靶點(diǎn)及差異基因。

本文通過(guò)利用R 軟件對(duì)NCBI（www.ncbi.com.cn）中的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索UC-MSCs 治療BC 的原始數(shù)據(jù)集GSE64827 進(jìn)行處理，篩出得出11 個(gè)差異基因，即PFKFB4、ALDOC、DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄物4（DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4）、碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9,CA9）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3（IGF-binding proteins 3,IGFBP3）、跨膜蛋白45A（transmembrane protein 45A,TMEM45A）、鋅指蛋白395（zink finger 395,ZNF395）、重組人胞內(nèi)氯離子通道蛋 白3（chloride intracellular channel protein 3,CLIC3）、NDUFA4L2、MGC23985、ANKRD37。

PFKFB4 在癌細(xì)胞糖酵解的調(diào)節(jié)及其增殖和存活中起重要作用［13］。目前，PFKFB4 已被確定為多種癌癥的關(guān)鍵分子［14］。研究表明［15］，PFKFB4 通過(guò)以p38信號(hào)通路誘導(dǎo)透明質(zhì)酸合酶2 (hyaluronan synthase 2，HAS2)表達(dá)和產(chǎn)生透明質(zhì)酸來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，PFKFB4 基因涉及的相關(guān)通路可能是UCMSCs 治療BC 發(fā)揮療效的機(jī)制之一。醛糖酶家族是參與糖酵解過(guò)程的主要酶之一。ALDOC 屬于醛縮酶家族，存在于正常腦組織中，負(fù)責(zé)修復(fù)受損組織［16］。由于PFKFB4 參與癌細(xì)胞糖酵解的調(diào)節(jié)及其增殖和存活，因此推斷ALDOC 蛋白可能參與BC 糖酵解的調(diào)節(jié)。由DDIT4 編碼的蛋白質(zhì)的主要功能是在壓力條件下抑制mTOR［17］。有研究表明［18］，mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥及腫瘤微環(huán)境中具有重要作用。因此，初步推斷DDIT4 可能是治療BC 的潛在選擇。CA9 是一種腫瘤相關(guān)酶［19］，在一些惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)［20］。

IGFBP3 是一種 p53 腫瘤抑制調(diào)節(jié)蛋白［21］。有研究發(fā)現(xiàn)，TMEM45A 與腫瘤進(jìn)展和侵襲有關(guān)［22］。在缺氧條件下，ZNF395 水平升高可能通過(guò)激活先天免疫反應(yīng)和癌癥的靶基因來(lái)參與炎癥和癌癥進(jìn)展［23］。CLIC3 是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的氯離子通道，其與腫瘤細(xì)胞的凋亡和遷移密切相關(guān)［24］。NDUFA4L2在TRHER2 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中高度表達(dá)［25］；MGC23985 等基因雖未找到相關(guān)報(bào)道，但從功能上看其與腫瘤有著密切的聯(lián)系?？傊@11 個(gè)差異基因也許可以成為BC 的治療突破口，為治療BC 提供新的方向。

PPI 網(wǎng)絡(luò)是了解細(xì)胞功能、疾病機(jī)制和藥物設(shè)計(jì)或其重新定位的可行工具［26］。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，一般選用節(jié)點(diǎn)的自由度值大小來(lái)表征節(jié)點(diǎn)基因的重要程度，即自由度值越大，節(jié)點(diǎn)基因越重要。一般對(duì)基因進(jìn)行GO富集分析，能夠找出差異基因與哪些生物功能的改變相關(guān)。KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)［27］（http：//www.kegg.jp/）主要用于進(jìn)一步了解生物學(xué)高級(jí)功能和生物體系，并從分子水平角度進(jìn)行基因的富集分析，找尋其中可能參與疾病發(fā)生和發(fā)展的信號(hào)通路。因此，本文通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的拓?fù)浜蟮腜PI 網(wǎng)絡(luò)得到了ALDOC、IGFBP3、DDIT4 和PFKFB4 這4 個(gè)關(guān)聯(lián)度較高的基因。通過(guò)GO 分析，得出涉及的主要基因?yàn)镻FKFB4、ALDOC、DDIT4 和CA9。通過(guò)KEGG 通路分析，得出涉及基因?yàn)锳LDOC，PFKFB4。

綜上，通過(guò)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)平臺(tái)可以初步預(yù)測(cè)出UC-MSCs 治療乳腺癌核心靶點(diǎn)有ALDOC、PFKFB4 和DDIT4。這些基因靶點(diǎn)為UCMSCs 治療BC 提供了新的作用機(jī)制思路。猜測(cè)UCMSCs 抑制BC 可能與糖代謝通路有關(guān)。未來(lái)采用UC-MSCs 調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)來(lái)參與抑制乳腺癌的發(fā)生是非?？赡艿?。但是，由于上述臨床數(shù)據(jù)樣本量小，缺乏大數(shù)據(jù)、大樣本的多中心隨機(jī)對(duì)照的試驗(yàn)進(jìn)行的臨床研究，且有關(guān)UC-MSCs 的治療BC 疾病的機(jī)制仍尚未完全闡明，因此需要更加深入地系統(tǒng)研究其治療的可能性機(jī)制，以確保UC-MSCs 能更好地應(yīng)用于BC的臨床治療中。