木糖選擇系統(tǒng)下xylA &BADH雙價(jià)基因?qū)Χψ拥倪z傳轉(zhuǎn)化

楊曉紅 陳曉陽

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院 北京 102206； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 廣州 510642)

運(yùn)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物性狀的遺傳改良已經(jīng)成為培育植物新品種的一種趨勢。在植物轉(zhuǎn)基因中，采用有效的選擇系統(tǒng)是植物轉(zhuǎn)基因成功與否的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前多數(shù)植物轉(zhuǎn)基因采用除草劑選擇系統(tǒng)和抗生素選擇系統(tǒng)，但這2種選擇系統(tǒng)的采用卻是引發(fā)公眾對轉(zhuǎn)基因生物安全性關(guān)注的一個(gè)重要原因。因此，培育具有安全性的基因工程植株對加快轉(zhuǎn)基因植物的商品化生產(chǎn)具有重要意義(葉紈芝等，2000)。以糖代謝途徑中的一些酶基因(如木糖異構(gòu)酶基因、磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因)作為轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記的正篩選系統(tǒng)是解決轉(zhuǎn)基因生物安全性問題的一種有效途徑(Haldrupetal.，2001)。

木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase，簡稱xylA)，又名葡萄糖異構(gòu)酶，該酶不僅能夠催化木糖代謝途徑中從木糖到木酮糖的轉(zhuǎn)化，而且能夠催化果糖和葡萄糖的異構(gòu)化，是食品工業(yè)上利用淀粉制備高果糖漿的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是利用植物材料生產(chǎn)乙醇的重要酶類，被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)和工業(yè)釀酒(Van Marisetal.，2008；Mertetal.，2017;Sathyaetal.，2020)。木糖異構(gòu)酶基因(xylA)廣泛存在于許多原核生物基因組中，在多數(shù)植物組織中呈現(xiàn)弱表達(dá)現(xiàn)象(Haldrupetal.，1998a；1998b)。大多數(shù)植物不能利用木糖但可以利用木酮糖，因此可以利用木糖作為這些植物遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇劑(Haldrupetal.，2001)。這種以xylA作為選擇標(biāo)記基因的木糖選擇系統(tǒng)是公認(rèn)的一種安全有效的選擇系統(tǒng)(Mikietal.，2004)。不同于抗生素選擇系統(tǒng)和除草劑選擇系統(tǒng)中殺死非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，在木糖選擇系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能夠利用木糖作為碳源維持生長分化，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞則因不能利用木糖而處于饑餓狀態(tài)，最后死亡，因此這種選擇系統(tǒng)也稱為正向選擇系統(tǒng)(Haldrupetal.，2001)。目前已經(jīng)獲得了經(jīng)木糖篩選的煙草(Nicotianatabacum)(Danielletal.，2001)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)(Liliusetal.,2000；Haldrupetal.,2001；Ewaetal.,2003)、番茄(Solanumlycopersicum)(Haldrupetal.，2001)、百脈根(Lotuscorniculatus)(韋正乙，2007)、玉米(Zeamays)(郭新梅等，2007)、花生(Arachishypogaea)(丁霄等，2012)等轉(zhuǎn)基因植株，這些轉(zhuǎn)基因植株中的xylA均來自原核生物。Kristo等(1996)首次從真核生物——大麥(Hordeumvulgare)中克隆出了xylA，后來趙建華等(2019)也從寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)中克隆出該基因，這為今后利用來自植物的木糖異構(gòu)酶基因開展基因工程研究創(chuàng)造了條件。盡管以xylA作為選擇標(biāo)記基因的研究較多，但是，主要集中在草本植物中，對木本植物的研究還未見報(bào)導(dǎo)，而且該基因?qū)雽χ参矬w內(nèi)糖代謝的影響方面的研究也很少，需要增強(qiáng)這方面的研究工作。

甜菜堿是一種廣泛存在于植物、動物、微生物細(xì)胞中的可溶性化合物(Rhodesetal.,2003；Takabeetal.,2006；Chenetal.,2008)，是一種具備滲透調(diào)節(jié)作用的小分子物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢、保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和代謝酶活性、保護(hù)細(xì)胞膜等功能(McNeiletal.，1999)。高等植物的甜菜堿合成途徑很簡單，首先在膽堿單氧化酶(CMO)的作用下將膽堿生成甜菜堿醛，再在甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)作用下形成甜菜堿(Sakamotoetal.，2000；Chenetal.，2011)。許多研究表明轉(zhuǎn)入甜菜堿醛脫氫酶基因可促進(jìn)植物對甜菜堿的積累，提高植物耐鹽性、抗旱性、耐寒性、耐熱性、抗重金屬毒性(Chenetal.,2008)。

二色胡枝子(Lespedezabicolor)是一種良好的水土保持樹種和飼料植物，具有多種利用價(jià)值(楊曉紅等，2019)。但是二色胡枝子只能在輕鹽堿立地上生長，在高鹽堿生境中不能存活(穆永光，2007)。為了進(jìn)一步提高二色胡枝子的耐鹽性和抗旱能力，培育出能夠被公眾接納的轉(zhuǎn)基因新品種，本試驗(yàn)以木糖為選擇劑，對二色胡枝子進(jìn)行xylA&BADH雙價(jià)基因的遺傳轉(zhuǎn)化，以期培育出耐非生物脅迫能力更強(qiáng)且安全的二色胡枝子新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以二色胡枝子的子葉節(jié)為試驗(yàn)材料，種子來源于美國喬治亞州。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404和EHA105、pBI121植物表達(dá)載體、來源于山菠菜(Atriplexhortensis)的BADH由北京林業(yè)大學(xué)的林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由北京農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室惠贈；引物合成和測序由上海生工完成；試驗(yàn)中用到的限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、SacⅠ、ClaⅠ、NheⅠ、ApaⅠ為TakaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、DNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；甜菜堿醛、抗生素為Sigma公司產(chǎn)品；Southern雜交試劑盒為北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；PUCm-T載體由上海生工提供；其他試劑由國內(nèi)公司提供。

1.2 xylA的克隆和序列分析

根據(jù)GenBank中大腸桿菌的xylA序列，設(shè)計(jì)1對引物，在上游引物中加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物中加入SacⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物(X1)為：5′-CGGGATCCATTATGGAGTTCAATATGC-3′，下游引物(X2)為：5′-TCGAGCTCTTATTTGTCGAAC AGATAATGG-3′。利用pfu DNA聚合酶采用PCR擴(kuò)增的方法從大腸桿菌中克隆出xylA片段，并將片段插入PUCm-T載體中進(jìn)行測序分析。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性30 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，0～4 ℃保存。

1.3 植物表達(dá)載體pBI121-xylA-BADH的構(gòu)建

將測序分析正確的xylA片段用BamHⅠ、SacⅠ酶切后插入到進(jìn)行了相同酶切的pBI121植物表達(dá)載體上，取代pBI121中的gus基因，構(gòu)建成pBI121-xylA植物表達(dá)載體。用1對引物：上游3B(帶有NheⅠ酶切位點(diǎn))、下游BN(帶有ClaⅠ酶切位點(diǎn))，采用PCR技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室保存的pBI121-BADH植物表達(dá)載體中擴(kuò)增出35S-BADH-nos片段，擴(kuò)增時(shí)利用保真度較高的Taq Platinum DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入到PUCm-T載體中進(jìn)行測序分析，將測序分析正確的35S-BADH-nos片段經(jīng)NheⅠ、ClaⅠ雙酶切后插入到進(jìn)行了同樣雙酶切的pBI121-xylA植物表達(dá)載體中，取代pBI121-xylA載體中的nos-P-nptⅡ-nos-T序列，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBI121-xylA-BADH。引物3B序列為：5′-AAAGCTAGCTCT TCGTCAACATGGTGGAGC-3′；引物BN序列為：5′-ATATCGATGGCCAGTGAATTCCCGATCT-3′(其中GCTAGC為NheⅠ酶切位點(diǎn)，ATCGAT為ClaⅠ酶切位點(diǎn))。BADH基因用引物B1:5′-CCAGGTCTAGA ATGGCGTTCC-3′，引物B2:5′-TTTTCAAGGAGACT TGTACCA-3′檢測。經(jīng)過驗(yàn)證將構(gòu)建正確的植物表達(dá)載體pBI121-xylA-BADH通過液氮凍融法分別轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA105中。35S-BADH-nos片段擴(kuò)增條件為：94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2.5 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，0～4 ℃保存。

1.4 以木糖為選擇劑的二色胡枝子的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

1.4.1 木糖對二色胡枝子組織分化的敏感性試驗(yàn)根據(jù)Haldrup等(1998a；1998b)對煙草和番茄的研究結(jié)果，在二色胡枝子遺傳轉(zhuǎn)化中，用木糖取代一定量的蔗糖來研究木糖對二色胡枝子分化、增殖和生根的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)4種處理：1)蔗糖15 g·L-1+木糖15 g·L-1；2)蔗糖10 g·L-1+木糖20 g·L-1；3)蔗糖5 g·L-1+木糖25 g·L-1；4)蔗糖0 +木糖30 g·L-1。除糖源外，二色胡枝子子葉節(jié)分化培養(yǎng)基：MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1；莖段增殖培養(yǎng)基為：MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1；生根培養(yǎng)基為：MS*+ NAA 0.1 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1。每處理接種25個(gè)材料左右，重復(fù)3次，接種6～8周后觀測二色胡枝子的子葉節(jié)、莖段在含有不同碳源培養(yǎng)基上的組織分化狀況。最終根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定木糖選擇系統(tǒng)中的木糖添加量。MS*為僅大量元素減半的MS培養(yǎng)基。

1.4.2 二色胡枝子遺傳轉(zhuǎn)化 先將二色胡枝子的種子播種在MS培養(yǎng)基上，待其萌發(fā)后切除頂芽、胚根，并在2個(gè)子葉的中間部位縱切一刀，即將子葉節(jié)部位劃傷，然后把材料接種在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為0、12、24、48 h。在方法1.4.1及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間篩選的基礎(chǔ)上，采用L4(23)正交設(shè)計(jì)，研究載體菌株類型、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對二色胡枝子子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響。載體分別為LBA4404、EHA105兩種根癌農(nóng)桿菌菌株，侵染時(shí)間為20 min和30 min，共培養(yǎng)時(shí)間為2天和3天。遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，外植體預(yù)培養(yǎng)1天，菌液濃度的OD600值約為0.6，菌液中加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮；用無菌濾紙輕輕吸干外植體上的菌液，再把植物材料接種在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1培養(yǎng)基上，在黑暗條件下使農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)2～3天；最后把共培養(yǎng)后的子葉節(jié)材料接種在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 頭孢霉素200～300 mg·L-1培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。8～10周后觀察結(jié)果。獲得的木糖抗性芽接種在MS*+ 6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1+ 木糖 25 g·L-1+ 蔗糖5 g·L-1+ 頭孢霉素200 mg·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性增殖培養(yǎng)，增殖后的抗性芽于MS*+ NAA 0.1 mg·L-1+ IBA 0.2 mg·L-1+ 瓊脂6 g·L-1+ 木糖 25 g·L-1+ 蔗糖 5 g·L-1+ 頭孢霉素 150 mg·L-1的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性生根。

1.5 轉(zhuǎn)基因二色胡枝子的PCR和Southern檢測

轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的總DNA提取采用CTAB法。用BADH的1對特異引物B1、B2進(jìn)行PCR檢測。植物DNA先用ApaⅠ進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳分離酶切產(chǎn)物，再轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，用地高辛標(biāo)記的BADH片段作為探針，按照Southern雜交試劑盒上的操作方法進(jìn)行Southern檢測。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性試驗(yàn)及鹽脅迫下的葉綠素、電導(dǎo)率、甜菜堿醛脫氫酶活性

將經(jīng)過分子檢測的轉(zhuǎn)基因植株和對照植株分別接種到含有0.5、1.0、1.5、2 g·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上，觀察轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性表現(xiàn)。

葉綠素測定采用丙酮法，用DDS-307型電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率。甜菜堿醛脫氫酶活性測定參照解小娟等(2013)的方法。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株及對照葉片中可溶性木糖、葡萄糖、果糖測定

取繁殖數(shù)量相對較多的一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對照材料的組培苗葉片0.5 g(非逆境脅迫下)，剪碎后放入玻璃試管中，加水10 mL，沸水浴30 min，冷卻后，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，再用碳18柱過濾以去除色素等雜質(zhì)，將濾液濃縮到2 mL，取100 μL用美國Waters公司高效液相色譜儀(型號：Sugar analyzer I，色譜柱為 Sugar-Park TM 1，流動相為超純水)分析可溶性木糖、葡萄糖、果糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 xylA基因的克隆和pBI121-xylA-BADH植物表達(dá)載體的構(gòu)建

從大腸桿菌中擴(kuò)增出與預(yù)估片段大小吻合的長約1 300～1 400 bp的片段，并送交上海生工進(jìn)行測序。測序結(jié)果(圖1A)經(jīng)過與GenBank公布的大腸桿菌xylA核苷酸序列進(jìn)行比對，選定的目標(biāo)DNA片段的核苷酸序列與xylA(NCBI-TaxID=526，Parent Accession：K01996.1)的同源性達(dá)到了100%，表明xylA被準(zhǔn)確地從大腸桿菌中克隆出來。

從pBI121-BADH植物表達(dá)載體中擴(kuò)增出35S-BADH-nos片段，將該片段插入到pUCm-T載體，構(gòu)建成pUCm-35S-BADH-nos載體后進(jìn)行測序，測序結(jié)果(圖1B)表明所擴(kuò)增產(chǎn)物與公布的核苷酸序列同源性為100%。再用xylA取代pBI121植物表達(dá)載體中的gus基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-xylA，經(jīng)PCR檢測，表明所構(gòu)建載體正確(圖1C)。用限制性核酸內(nèi)切酶NheⅠ和ClaⅠ對pUCm-35S-BADH-nos載體和pBI121-xylA載體進(jìn)行雙酶切，用35S-BADH-nos片段取代pBI121-xylA載體中的nos-P-nptⅡ-nos-T序列，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBI121-xylA-BADH，經(jīng)PCR檢測和用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ酶切檢測(圖1D)，證實(shí)所構(gòu)建載體正確，獲得了植物表達(dá)載體pBI121-xylA-BADH(圖1E)。

2.2 木糖對二色胡枝子組織分化的影響

試驗(yàn)控制總糖含量為30 g·L-1，配制培養(yǎng)基時(shí)用木糖取代部分或全部蔗糖來研究木糖對二色胡枝子子葉節(jié)分化、莖段增殖、生根的影響。結(jié)果(表1)顯示，二色胡枝子在子葉節(jié)分化、莖段增殖、組培苗生根過程中，基本上不能利用木糖作為組織分化過程中的唯一碳源。在子葉節(jié)分化中，雖然觀測到個(gè)別材料能在純木糖培養(yǎng)基上分化出不定芽，但是經(jīng)過一段時(shí)間后該芽會死亡。二色胡枝子組織分化能力受培養(yǎng)基中木糖含量影響(表1)。當(dāng)培養(yǎng)基中木糖含量25 g·L-1、蔗糖5 g·L-1時(shí)，52%的子葉節(jié)能夠分化出不定芽，但是莖段無法分化出不定芽，材料也不能生根；當(dāng)培養(yǎng)基中木糖含量20 g·L-1、蔗糖10 g·L-1時(shí)，二色胡枝子子葉節(jié)的分化能力明顯增強(qiáng)，有68%的子葉節(jié)分化出不定芽，平均每個(gè)子葉節(jié)分化出的不定芽數(shù)為0.3，達(dá)到對照的7%，但是莖段分化率和生根率仍然較低；當(dāng)培養(yǎng)基中的木糖、蔗糖含量均為15 g·L-1時(shí)，子葉節(jié)分化率能夠達(dá)到90%，莖段分化率和生根率也分別達(dá)到對照的23.4%和45.7%，而且每個(gè)子葉節(jié)平均能分化出0.9個(gè)不定芽。由此可見，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源用木糖取代蔗糖時(shí)，木糖取代量越大，對各類組織分化的影響越大，培養(yǎng)基中蔗糖含量越少，各類組織的分化能力越低。因此，當(dāng)以木糖為選擇劑對二色胡枝子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，應(yīng)在純木糖培養(yǎng)基上篩選抗性芽，而在抗性芽增殖和生根過程中，可采用木糖25 g·L-1、蔗糖5 g·L-1的混合糖劑進(jìn)行篩選。

表1 木糖對二色胡枝子子葉節(jié)再生、莖段分化及組培苗生根的影響①Tab.1 Effects of xylose on the regeneration of adventitious buds from cotyledonary node,shoot segment multiplication and rooting ability in vitro

2.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌種、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效果的影響

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對二色胡枝子遺傳轉(zhuǎn)化影響見表2。不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的處理得不到木糖抗性芽，預(yù)培養(yǎng)12 h和24 h的處理均得到2個(gè)能再生的抗性芽，而預(yù)培養(yǎng)48 h的處理只得到了1個(gè)能再生的抗性芽。因此在二色胡枝子遺傳轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間適合采用12～24 h。采用L4(23)正交設(shè)計(jì)，研究載體菌株類型、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對二色胡枝子子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見表3。對二色胡枝子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，LBA4404(Oct型)菌株的轉(zhuǎn)化效果要好于EHA105(Nop型)菌株，在純木糖選擇壓下，LBA4404菌株平均獲得的抗性芽再生率可達(dá)5.85%，而EHA105菌株平均獲得的抗性芽再生率只有1.8%。采用LBA4404菌株分別侵染20 min和30 min，均可獲得能夠再生的抗性芽。利用農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，共培養(yǎng)3天的效果好于共培養(yǎng)2天。

表2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效果的影響①Tab.2 Effect of pre-culture on transformation frequencies

表3 菌種、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效果的影響Tab.3 Effects of bacterium strains,infection time and cocultivation time on transformation frequencies

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR和Southern檢測

用木糖作選擇劑，對278個(gè)子葉節(jié)外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了木糖抗性芽(圖2)13個(gè)，抗性芽獲得率為4.7%。隨機(jī)選取4個(gè)繁殖數(shù)量相對較多的木糖抗性株系，對BADH基因進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果(圖3a)表明，隨機(jī)選取的這4個(gè)轉(zhuǎn)化株系和陽性質(zhì)粒都擴(kuò)增出了大約1 520 bp的特異性條帶，而陰性對照則未見條帶，初步表明有可能獲得二色胡枝子的轉(zhuǎn)基因植株。

圖2 xylA &BADH轉(zhuǎn)化后的木糖抗性芽Fig.2 The xylose-tolerant buds transformed with xylA &BADH a:轉(zhuǎn)化后20天;b:轉(zhuǎn)化后45天。a:20 d after transformation;b:45 d after transformation.

經(jīng)分析，在pBI121-xylA-BADH質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段的核苷酸序列中沒有ApaⅠ酶切位點(diǎn)。將4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及對照的DNA經(jīng)ApaⅠ酶切后，其Southern雜交結(jié)果見圖3b。質(zhì)粒陽性對照的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了1條雜交帶，2號、4號轉(zhuǎn)化株系各顯示出1條雜交帶，而1號、3號轉(zhuǎn)化株系以及陰性對照未見雜交信號，表明BADH基因被單拷貝插入到2號、4號這2個(gè)轉(zhuǎn)化株系的基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)xylA &BADH基因植株的BADH的PCR和Southern檢測Fig.3 PCR amplification and Southern blot analysis for BADH of xylA &BADH transgenic plantsa:PCR檢測(1 520 bp);b:Southern檢測。M:DNA marker;CK+:質(zhì)粒;CK-:未轉(zhuǎn)化植株;1-4:轉(zhuǎn)化植株。a:PCR analysis(1 520 bp);b:Southern blot analysis.M:DNA marker;CK+:Plasmid;CK-:Wild-type plants;1-4:Putative transgenic plants.

2.5 NaCl脅迫對轉(zhuǎn)基因植株組培苗的影響

將經(jīng)過分子檢測和擴(kuò)繁的2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與對照植株接種到含有不同鹽濃度的生根培養(yǎng)基上，生長1個(gè)月后觀察發(fā)現(xiàn)：在0.5 g·L-1NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株的生長表現(xiàn)沒有明顯差別，但是隨著鹽濃度的加大，二者在耐鹽性上有了明顯差異，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系植株在含有2 g·L-1NaCl的培養(yǎng)基上均能夠正常生長，并分化出根系，而非轉(zhuǎn)基因植株在含有2 g·L-1NaCl的培養(yǎng)基上表現(xiàn)出葉片變黃脫落，不能分化出根系等現(xiàn)象(圖4)。

圖4 2 g·L-1 NaCl對二色胡枝子轉(zhuǎn)基因及對照植株的影響Fig.4 The effect of 2 g·L-1 NaCl on transgenic and wild-type L. bicolora:生長在含有2 g·L-1 NaCl培養(yǎng)基上的xylA &BADH轉(zhuǎn)化植株;b:生長在含有2 g·L-1 NaCl培養(yǎng)基上的非轉(zhuǎn)基因植株;c:在含有 2 g·L-1 NaCl培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因植株(左)與非轉(zhuǎn)基因植株(右)生根情況。a:xylA &BADH tansgenic plant on the medium contained 2 g·L-1 NaCl;b:Wild-type plants on the medium contained 2 g·L-1 NaCl;c:Rooting of transgenic plant (left)and wild-type plants (right)on the mediums contained 2 g·L-1 NaCl.

對生長于1 g·L-1NaCl培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因材料與對照材料進(jìn)行葉綠素含量、電導(dǎo)率及甜菜堿醛脫氫酶(BADH)活性測定，結(jié)果(表4)顯示，在未進(jìn)行鹽處理前，2個(gè)轉(zhuǎn)入xylA&BADH基因的二色胡枝子株系中的BADH酶活性與非轉(zhuǎn)基因的對照植株沒有明顯差異；經(jīng)鹽處理1個(gè)月后，非轉(zhuǎn)基因植株的BADH酶活性沒有明顯變化，而轉(zhuǎn)基因植株的BADH酶活性得到了較大幅度的提升，并達(dá)到對照植株的8～10倍。鹽處理前，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量、電導(dǎo)率也不存在顯著性差異，但是經(jīng)過鹽處理后，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，而電導(dǎo)率則明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。上述結(jié)果表明：外源BADH基因?qū)攵ψ雍竽軌虬l(fā)揮相應(yīng)功能，從而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。

表4 NaCl脅迫對轉(zhuǎn)xylA &BADH基因二色胡枝子生理指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of NaCl stress on physiological indexes of xylA &BADH transgenic plants

2.6 外源基因?qū)雽χ仓耆~片中可溶性木糖、葡萄糖、果糖的影響

用高效液相色譜儀分析轉(zhuǎn)基因植株與對照葉片中的可溶性糖成分及含量，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因的二色胡枝子組培苗葉片中僅測出了葡萄糖(保留時(shí)間為17.5 min)，且每克鮮葉中含量為1.218 mg，未檢測出木糖(保留時(shí)間為15.0 min)和果糖(保留時(shí)間為16.3 min)；轉(zhuǎn)基因植株組培苗的葉片中則測出了果糖和葡萄糖，其中果糖含量為0.623 mg·g-1，葡萄糖含量為0.662 mg·g-1，未檢測出木糖。此外，在非轉(zhuǎn)基因植株中還測出了另一種未標(biāo)定的單糖成分(其保留時(shí)間為18.76 min)。

3 討論

在植物轉(zhuǎn)基因研究中，多利用xylA作為選擇標(biāo)記基因，以木糖為選擇劑，而有關(guān)木糖異構(gòu)酶基因在植物中對糖代謝影響研究則相對較少。Lilius等(2000)對轉(zhuǎn)入熱穩(wěn)定性葡萄糖異構(gòu)酶(也叫木糖異構(gòu)酶)基因的馬鈴薯進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，田間生長的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的果糖含量比非轉(zhuǎn)基因材料高。本研究用來自大腸桿菌的xylA作為選擇標(biāo)記基因?qū)Χψ舆M(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因組培苗葉片中能測定出果糖和葡萄糖，而非轉(zhuǎn)基因的同類材料只能測定出葡萄糖，測不出果糖，進(jìn)一步表明木糖異構(gòu)酶能促進(jìn)植株內(nèi)葡萄糖與果糖的異構(gòu)化。此外，研究中利用高效液相色譜還在二色胡枝子的非轉(zhuǎn)基因材料中測出了一種保留時(shí)間為18.76 min的糖成分，由于試驗(yàn)中僅標(biāo)記了木糖、葡萄糖、果糖，該糖名稱不確定。Ewa等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)來自大腸桿菌xylA的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中一種己糖成分發(fā)生了改變，從而影響了器官的新陳代謝。本研究中，轉(zhuǎn)基因的二色胡枝子所轉(zhuǎn)入的基因也有來自大腸桿菌的xylA，該基因的表達(dá)可能影響了植株內(nèi)的糖代謝，才使得轉(zhuǎn)基因材料與非轉(zhuǎn)基因材料測出了不同類型的糖成分。

Haldrup等(2001)研究認(rèn)為，以糖代謝中的一些酶基因作為轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記的正篩選系統(tǒng)可獲得比負(fù)選擇系統(tǒng)更高的遺傳轉(zhuǎn)化率。以玉米、馬鈴薯和紫花苜蓿(Medicagosativa)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化為例，以甘露糖為選擇劑時(shí)，三者轉(zhuǎn)入磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化率分別為30%(Negrottoetal.，2000)、53.3%(Bízaetal.，2008)、39.6%(王婷等，2008)，而抗生素選擇系統(tǒng)在優(yōu)化條件下的遺傳轉(zhuǎn)化率分別為30%(Ishidaetal.，1996)、36.8%(張寧等，2004)、30%(謝鑫星等，2010)。以上結(jié)果說明以磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因作為選擇標(biāo)記基因的糖類選擇系統(tǒng)可以獲得比抗生素選擇系統(tǒng)更高的遺傳轉(zhuǎn)化率。而以木糖為選擇劑，以木糖異構(gòu)酶基因作為選擇標(biāo)記基因的遺傳轉(zhuǎn)化中，不同材料的遺傳轉(zhuǎn)化效率表現(xiàn)不同。馬鈴薯和番茄的木糖選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化效率高于其抗生素選擇系統(tǒng)，而煙草的木糖選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化效率低于其抗生素選擇系統(tǒng)(Haldrupetal.，2001)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化研究中，以木糖為選擇劑，對花生的胚小葉外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其木糖選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化率在11.2%～11.7%(丁霄等，2012)，而花生胚小葉的抗生素選擇系統(tǒng)在優(yōu)化條件下的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率為12%～36%(Egninetal.，1998)；當(dāng)以浸泡吸水后的花生半粒種子為轉(zhuǎn)化受體，以除草劑為選擇劑時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化率可高達(dá)69.03%(朱軍等，2018)。這些研究表明花生的抗生素或除草劑選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化效率高于木糖選擇系統(tǒng)。本研究中，二色胡枝子子葉節(jié)外植體的木糖選擇系統(tǒng)的抗性芽獲得率為4.7%。隨機(jī)選出的4個(gè)繁殖數(shù)量較多的木糖抗性株系的PCR結(jié)果顯示均可擴(kuò)增出目的基因片段。假定其他未檢測的抗性株系均可通過PCR檢測，本次試驗(yàn)的二色胡枝子木糖選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化率最高只能達(dá)到4.7%，而同樣轉(zhuǎn)化方法的二色胡枝子抗生素選擇系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化率為2%(黃天偉，2009)，說明二色胡枝子的遺傳轉(zhuǎn)化效率還比較低，其遺傳轉(zhuǎn)化方法有待于進(jìn)一步提高。

許多細(xì)胞相溶性物質(zhì)能提高植物對逆境的適應(yīng)能力，甜菜堿就是其中研究最多的一種物質(zhì)。甜菜堿醛脫氫酶(BADH)是甜菜堿合成中的關(guān)鍵酶，轉(zhuǎn)BADH植物中積累甜菜堿提高了植物對各種逆境的適應(yīng)能力(Chenetal.，2011)。本次對轉(zhuǎn)入BADH的二色胡枝子的研究顯示：轉(zhuǎn)基因植株能夠提高鹽脅迫下BADH酶活性，降低鹽脅迫下葉片的電導(dǎo)率和維持較高的葉綠素含量。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)入BADH確實(shí)能提高植物對逆境的適應(yīng)能力。

PCR檢測和Southern檢測是對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測中最常用的技術(shù)手段。PCR技術(shù)雖然具有敏感性高、操作簡單迅速、對樣品純度要求不高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增、不能闡明外源基因在植株內(nèi)的整合狀況等缺點(diǎn)(Erlich，1989)。Southern雜交技術(shù)是當(dāng)前鑒定外源基因整合的權(quán)威方法，該法是以目的基因的DNA為探針與被檢測植株的DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)，因此要求DNA具備一定的純度、長度和濃度，當(dāng)雜交樣品的DNA純度不合格或濃度過低時(shí)，雜交常無信號(閆新甫等,2003)。本次試驗(yàn)中，因?yàn)椴煌晗档霓D(zhuǎn)基因材料擴(kuò)繁速率不同，受繁殖材料限制，各個(gè)株系材料提取的植物總DNA濃度存在差異。對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR檢測時(shí)，有4個(gè)株系擴(kuò)增出了BADH條帶，但是在Southern檢測中則僅有2個(gè)株系出現(xiàn)了雜交條帶。造成此種現(xiàn)象的原因可能有以下3方面：1)試驗(yàn)材料的DNA濃度達(dá)不到要求；2)提取植物總DNA的材料為組培苗，可能還攜帶一定數(shù)量的農(nóng)桿菌；3)外源基因雖然進(jìn)入了植株體內(nèi)，但是并沒有整合到植物的基因組。盡管通過Southern檢測顯示2號、4號這2個(gè)株系的雜交信號強(qiáng)弱不同(圖3b)，但是通過對NaCl脅迫下2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系BADH酶活性測定結(jié)果分析，這2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的BADH酶活性并不存在明顯差異，也從另一角度說明這2個(gè)株系的外源基因拷貝數(shù)是相同的。造成2個(gè)株系的Southern檢測信號差異的原因是因?yàn)檫M(jìn)行圖3b的Southern雜交檢測時(shí)，受轉(zhuǎn)化材料繁殖數(shù)量的限制，2個(gè)株系提取植物總DNA時(shí)材料用量不同，因而提取的DNA濃度存在差異，經(jīng)ApaⅠ酶切后，從而在圖3b的Southern雜交反應(yīng)中顯現(xiàn)出強(qiáng)弱不同的雜交信號帶。

4 結(jié)論

測序結(jié)果表明從大腸桿菌中成功克隆出木糖異構(gòu)酶基因，并正確構(gòu)建了pBI121-xylA-BADH植物表達(dá)載體。當(dāng)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以木糖為選擇劑對二色胡枝子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，可以獲得轉(zhuǎn)入xylA&BADH雙價(jià)基因的轉(zhuǎn)基因植株。外源甜菜堿醛脫氫酶基因的導(dǎo)入能夠提高二色胡枝子的耐鹽性。來自大腸桿菌的外源木糖異構(gòu)酶基因的導(dǎo)入，會影響二色胡枝子組培苗葉片內(nèi)的糖代謝。