發(fā)酵乳中沙門氏菌依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增快速檢測方法的建立

王 贊，李 獻(xiàn)，王 慧，許苗苗，張 捷，劉 帥，周 巍,2,*，史國華,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050000）

發(fā)酵乳作為人們?nèi)粘Ｊ秤玫囊环N乳制品，因其營養(yǎng)豐富、鈣含量高，添加各種水果、果醬后適口性好，乳糖不耐受的人群也可以食用，得到各年齡段消費(fèi)者的喜愛[1]。發(fā)酵乳中含有大量益生菌，能有效改善腸胃脹氣，對促進(jìn)消化有顯著作用。同時(shí)發(fā)酵乳還是人體較好的鈣元素來源，長期適量食用發(fā)酵乳對減少心血管疾病、降低膽固醇有一定的功效。

目前我國市面上銷售的發(fā)酵乳主要有普通發(fā)酵乳、風(fēng)味型發(fā)酵乳和功能型發(fā)酵乳。發(fā)酵乳一般由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌發(fā)酵制成，經(jīng)過對發(fā)酵菌株多年的研究，人們發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)秀發(fā)酵菌種，其發(fā)酵的酸乳口感更加細(xì)膩，如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌[2]。因發(fā)酵乳含有豐富的益生菌，其運(yùn)輸貯藏過程對溫度要求較為嚴(yán)格，4 ℃左右的低溫條件下益生菌存活時(shí)間較長。在實(shí)際情況中，貯藏條件、微生物污染等影響發(fā)酵乳的質(zhì)量和貨架期，微生物中有害菌的增殖是引起發(fā)酵乳變質(zhì)的重要原因。已發(fā)生過沙門氏菌和肉毒桿菌污染酸乳，造成食物中毒的事件[3-4]。

沙門氏菌作為酸乳中的一種有害微生物，感染后潛伏期為1～3 周不等，最長潛伏期可達(dá)2 個(gè)月，癥狀主要為食欲不振、高熱、嗜睡、頭疼、腹痛、腹瀉等，病程會(huì)持續(xù)2～4 周，感染后死亡率可高達(dá)10%[5]。沙門氏菌是各國和國際組織食品安全標(biāo)準(zhǔn)中普遍提出限量要求的致病菌[6]，快速、精準(zhǔn)、省時(shí)、省力的檢測更符合實(shí)際生產(chǎn)要求[7-9]。

國內(nèi)各類檢測機(jī)構(gòu)對于食品中污染菌及致病菌的檢測方法主要有國標(biāo)方法、分子生物學(xué)方法和基于免疫學(xué)的檢測方法[10-13]。國標(biāo)方法需要將目標(biāo)微生物進(jìn)行各種染色實(shí)驗(yàn)及生化實(shí)驗(yàn)，方法較為可靠，具有精準(zhǔn)、直觀、假陽性低的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是增菌、分離、純化等步驟時(shí)間較長，無法滿足快速檢測的需求。分子生物學(xué)方法自發(fā)明以來，因其靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)應(yīng)用非常廣泛[11]，但其擴(kuò)增效果受多種因素影響，常引起非特異性擴(kuò)增，且所需儀器價(jià)格昂貴，在基層不能得到廣泛推廣[14]。依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）快速檢測方法是以分子生物學(xué)方法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種新的基因擴(kuò)增方法，和其他方法相比，HDA法更簡單有效[15]。HDA快速檢測法主要是在恒溫條件下，由解旋酶打開DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）與形成的單鏈DNA相結(jié)合，使解開的單鏈保持穩(wěn)定，為引物提供結(jié)合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補(bǔ)鏈，解旋酶再次將新合成的雙鏈解開形成單鏈，新形成的單鏈成為模板，進(jìn)入下一輪循環(huán)擴(kuò)增，如此反復(fù)循環(huán)，靶序列可以實(shí)現(xiàn)指數(shù)增長[16-17]。HDA法的特異性反應(yīng)較強(qiáng)，所需儀器設(shè)備較為基礎(chǔ)，可在短時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)[18]，適合基層快速、現(xiàn)場檢測。

本研究將HDA方法應(yīng)用到發(fā)酵乳中沙門氏菌的檢測中，利用該方法自身特點(diǎn)，結(jié)合乳制品生產(chǎn)企業(yè)對于基層快速、準(zhǔn)確檢測的需求，開發(fā)出滿足基層檢測機(jī)構(gòu)現(xiàn)場檢測的HDA檢測體系，也為HDA技術(shù)在其他污染菌和致病菌檢測中的應(yīng)用推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

200 批次發(fā)酵乳 當(dāng)?shù)爻屑笆袌?。?shí)驗(yàn)用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in this study

脫氧核糖核苷三磷酸、Tris-HAc、腺嘌呤核苷三磷酸、DNA Marker、高效液相色譜級(jí)引物 生工生物工程（上海）有限公司；多胺、Phi29嗜溫聚合酶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、RecA蛋白、海藻糖、二硫蘇糖醇、Bst聚合酶、Lysis Buffer、蛋白酶K美國Sigma公司；T4 gp32蛋白、UvrD解旋酶 新西蘭Biolabs公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）培養(yǎng)基美國BD公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、亞硫酸鉍（BS）瓊脂北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 東方電工儀器廠；Reference?2微量電動(dòng)移液器 德國Eppendorf公司；BHC-300IIA/B3生物安全柜 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；MS3振蕩渦旋混勻器 德國IKA公司；MIR254恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Whatman T梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀 德國耶拿分析儀器股份公司；FiveEasy Plus?pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；3K15冷凍高速離心機(jī)德國Sigma公司；Gel Doc（MP）凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、電泳儀 美國伯樂公司；NanoDrop 1000微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 沙門氏菌特異性引物設(shè)計(jì)

通過查閱文獻(xiàn)[19-21]分析沙門氏菌的基因序列，從Genebank數(shù)據(jù)庫中公布的已知序列中選取特異性強(qiáng)、進(jìn)化穩(wěn)定且相對保守的通用目的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將沙門氏菌invA基因選定為靶標(biāo)基因，將確定的基因序列進(jìn)行BLAST在線比對，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物探針，并通過Oligo 7.37進(jìn)行驗(yàn)證，獲得沙門氏菌特異性檢測引物，如表2所示。

表2 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 2 Primer sequence and size of the PCR products

1.3.2 菌株基因組DNA提取

將所需菌株用營養(yǎng)肉湯指示培養(yǎng)基進(jìn)行活化，在適宜的溫度下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接傳代3 次，備用。將傳代3 次的細(xì)菌培養(yǎng)液充分搖勻，吸取100 μL增菌液加入到2 mL滅菌透明離心管中；將400 μL融化至室溫的Reagent D溶液移入裝有增菌液的離心管中，靜置避光培養(yǎng)5 min；將離心管放置于鹵素?zé)粝?，曝光培養(yǎng)5 min后，8 000 r/min離心5 min；去除上清液，在離心管中加入100 μL無菌去離子水，渦旋振蕩，制成可直接用于提取基因組DNA的菌懸液。

采用FoodProof磁珠提取儀法提取實(shí)驗(yàn)所需菌株基因組DNA。取1 mL上述菌懸液加入2 mL試管中，8 000 r/min離心5 min，移除上清液，在沉淀物中添加700 μL Lysis Buffer及80 μL蛋白酶K，放入振蕩水浴鍋中65 ℃振蕩30 min，取出12 000×g離心5 min，取上清液，備用。準(zhǔn)備儀器需要的Tip plate、Binding plate、Washing plate Ⅰ、Washing plate Ⅱ、Washing plate Ⅲ、Elution plate，使用微量移液器將各板對應(yīng)的Buffer添加至樣品孔，將250 μL Binding buffer和20 μL磁珠顆?；旌暇鶆?，加入Binding plate樣品孔中，600 μL Washing buffer Ⅰ加入到Washing plate Ⅰ樣品孔，800 μL Washing buffer Ⅱ加入到Washing plate Ⅱ樣品孔，80 μL Elution buffer加入到Elution plate。取第1步離心完畢添加過Lysis Buffer的裂解液500 μL，轉(zhuǎn)移至加入磁珠顆粒的Binding plate和Binding buffer對應(yīng)樣品孔。打開儀器，選擇MPKⅣ程序，將板子放入指定位置，開始自動(dòng)提取，待程序運(yùn)行完畢，卸載相應(yīng)板子，移除樣品孔廢液，轉(zhuǎn)移Elution plate上提取的DNA至潔凈離心管，直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 HDA反應(yīng)體系優(yōu)化和建立

采用時(shí)間短、較為便捷的一步法HDA反應(yīng)體系：5 μL 10×Buffer（含1 mg/mL BSA、100 mmol/L二硫蘇糖醇、350 mmol/L Tris-HAc、100 mmol/L MgSO4）、10 U Bst聚合酶、0.16 μmol/L ATP、0.04 μmol/L dNTPs、0.1 μg UvrD解旋酶、25 μmol/L海藻糖、5.0 μg T4 gp32、2 μL模板DNA、終濃度為20 pmol/L的引物，最后用ddH2O補(bǔ)至50 μL[15-16]。僅對反應(yīng)體系中UvrD解旋酶、T4 gp32的添加量進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)條件：65 ℃金屬浴、恒溫2 h。

UvrD解旋酶添加量的優(yōu)化：選擇UvrD解旋酶添加量分別為0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 μg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定不同靶標(biāo)菌株反應(yīng)體系中較適UvrD解旋酶添加量。

T4 gp32添加量的優(yōu)化：選擇T4 gp32添加量分別為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 μg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定不同靶標(biāo)菌株反應(yīng)體系中較適T4 gp32添加量。

HDA結(jié)果檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（恒壓100 V，電泳45 min），通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。

1.3.4 HDA法檢測沙門氏菌的特異性

為了驗(yàn)證沙門氏菌HDA法檢測特異性，將表1與沙門氏菌進(jìn)化關(guān)系較近且易影響檢測結(jié)果的金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎克羅諾桿菌、嬰兒雙歧桿菌、大腸埃希氏菌及嗜熱鏈球菌經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，按照1.3.2節(jié)建立的方法提取相應(yīng)菌株的DNA，加入1.3.3節(jié)建立并優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。

1.3.5 HDA法檢測靶標(biāo)菌株的產(chǎn)物分析

將沙門氏菌基因組DNA加入到1.3.3節(jié)建立的反應(yīng)體系中，用HDA法擴(kuò)增后，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳（100 V、45 min）?；厥漳z產(chǎn)物的目的條帶并純化，送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線BLAST，比較擴(kuò)增產(chǎn)物的同源性。

1.3.6 HDA法檢測實(shí)際樣品中沙門氏菌的檢出限

將采購的樣品按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢測，用定量方法證實(shí)所購樣品中不含沙門氏菌。將沙門氏菌人為添加到發(fā)酵乳中，將其含量控制在2.6×100～2.6×107CFU/g，按照1.3.2節(jié)方法提取菌株基因，加入1.3.3節(jié)建立并優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果得到其檢出限。

1.3.7 實(shí)際樣品測定

用HDA法和GB 4789.4—2016方法同時(shí)對所購200 批次樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 HDA法反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

圖2 HDA法T4 gp32添加量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中沙門氏菌電泳圖Fig. 2 Electrophoretogram of showing optimal concentration of T4 gp32

由圖1～2可知，當(dāng)UvrD解旋酶添加量為0.1 μg、T4 gp32添加量為5.0 μg時(shí)，肉眼可見清晰、明亮條帶，此優(yōu)化條件下沙門氏菌HDA法檢測效果較好。

圖1 HDA法UvrD解旋酶添加量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中沙門氏菌電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram showing optimal concentration of UvrD helicase

2.2 沙門氏菌HDA法檢測特異性

由圖3可知，乙型副傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌均有長度為304 bp的清晰、明亮擴(kuò)增條帶，與目的片段大小一致，而與沙門氏菌進(jìn)化關(guān)系較近易影響檢測結(jié)果的金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、阪崎克羅諾桿菌、嬰兒雙歧桿菌、大腸埃希氏菌、嗜熱鏈球菌按照優(yōu)化后的HDA法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均無擴(kuò)增現(xiàn)象，說明該方法對沙門氏菌檢測的特異性良好。

圖3 HDA法沙門氏菌特異性檢測電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram showing specificity of HAD for Salmonella

2.3 HDA法檢測沙門氏菌回收凝膠產(chǎn)物測序結(jié)果分析

將回收凝膠產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST在線比對。由表3可知，使用HDA法靶向invA基因檢測沙門氏菌的擴(kuò)增產(chǎn)物同源性為100%，其擴(kuò)增產(chǎn)物均為目的擴(kuò)增產(chǎn)物，證實(shí)了該方法的可行性。

表3 沙門氏菌回收凝膠產(chǎn)物與NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST比對結(jié)果Table 3 Results of BLAST alignment between recovered products and NCBI database

2.4 沙門氏菌HDA法測定檢出限

由圖4可知，泳道7的條帶清晰、明亮，得到發(fā)酵乳中沙門氏菌HDA法檢測的靈敏度為2.6×102CFU/g，滿足基層及生產(chǎn)過程中的檢測需求。

圖4 HDA法檢測沙門氏菌靈敏度電泳圖Fig. 4 Electrophoretogram showing sensitivity of HDA for Salmonella

2.5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

對購置的200 批次發(fā)酵乳樣品同時(shí)用HDA法和GB 4789.4—2016方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：HDA法檢測出陽性樣品3 批次，陰性樣品197 批次；國標(biāo)方法檢測出陽性樣品1 批次，陰性樣品199 批次。證實(shí)該檢驗(yàn)方法真實(shí)可靠，具有可推廣性。

3 結(jié) 論

HDA法與國標(biāo)方法相比較，檢出結(jié)果更加精確、耗時(shí)短、操作簡便；與其他擴(kuò)增方法相比較，HDA法對設(shè)備要求不高，僅需要滿足條件的金屬浴和恒溫水浴振蕩培養(yǎng)設(shè)備即可，普通實(shí)驗(yàn)室均具備該條件，對于生產(chǎn)環(huán)節(jié)中現(xiàn)場采樣也較易實(shí)現(xiàn)；其次，HDA法相比于其他恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)，在引物設(shè)計(jì)上采用了與普通PCR相同的方法[12]，降低了假陽性率[11,19]。結(jié)合本研究檢測結(jié)果，該方法在生產(chǎn)企業(yè)過程控制、基層檢測部門都有良好的適用性，符合我國檢測技術(shù)發(fā)展規(guī)律，前景廣闊。

本研究通過HDA法，建立快速、精準(zhǔn)、可推廣的檢測發(fā)酵乳中沙門氏菌的方法，該方法由沙門氏菌invA基因序列為目的基因，設(shè)計(jì)沙門氏菌特異性引物，進(jìn)行電泳檢測，同時(shí)保持相對固定體系含量，優(yōu)化反應(yīng)體系中UvrD解旋酶、T4 gp32添加量。最終確定體系（50 μL）中UvrD解旋酶的添加量為0.10 μg，T4 gp32添加量為5.0 μg，該條件下沙門氏菌檢測特異性良好，且得到與設(shè)計(jì)片段長度一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢出限為2.6×102CFU/g。通過HDA方法直接檢測發(fā)酵乳中沙門氏菌有其一定的優(yōu)勢，設(shè)備簡單、特異性強(qiáng)、反應(yīng)靈敏，適用于乳制品加工各環(huán)節(jié)沙門氏菌的檢測，為監(jiān)管部門提供了一種新的方法。