河北省部分地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型篩選及兼性菌毛株的致病性

關(guān)一凡，李 妍，高亞桃，常麗云，楊曉彤，賈仲昕，秦建華，趙月蘭

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

犢牛大腸桿菌病(calf colibacillosis)又被稱為犢牛白痢，是由某些致病性的大腸桿菌引起犢牛腹瀉、脫水、酸中毒及死亡的一種全球性急性傳染病。此病呈散發(fā)或地方性流行，一年四季均可發(fā)生，尤其冬春季節(jié)常見。出生1月齡內(nèi)的牛易感染本病，主要的病理變化大都集中在消化道，有的在臍部或生殖道。大腸桿菌也是一種條件致病菌[1]，一般情況下，大腸桿菌存在于人或動(dòng)物的腸道，與其他有益菌共存，維持腸道菌群平衡狀態(tài)。在某些因素影響下，導(dǎo)致腸道內(nèi)致病性大腸桿菌增多，由于犢牛抵抗力低下，難以抵御感染，最終造成大腸桿菌病的發(fā)生。大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，至今為止，被發(fā)現(xiàn)的O抗原約有180種，K抗原有103種，H抗原有60多種，F(xiàn)抗原有17種[2]，而且抗原的種類也在不斷變化，常會(huì)導(dǎo)致新抗原的產(chǎn)生。據(jù)相關(guān)學(xué)者報(bào)道，大腸桿菌可以通過菌毛黏附定居在腸道黏膜的上皮細(xì)胞，使腸道黏膜受損，導(dǎo)致功能異常、引發(fā)腹瀉[3-4]。

近些年來，在我國由大腸桿菌引起犢牛腹瀉的發(fā)病率高達(dá)90%，病死率為40%～50%[5]，給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從河北省4個(gè)地區(qū)奶牛場采集犢牛腹瀉糞便，通過對(duì)病原的分離鑒定、篩選其優(yōu)勢血清型，并鑒定出菌毛類型，利用小鼠致病性試驗(yàn)分析其毒力，以期為控制犢牛大腸桿菌病的發(fā)生提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物21日齡昆明小鼠，購自斯貝福(北京)生物有限公司。

1.2 主要試劑DL1000 DNA Marker、Taq酶、10×Buffer、dNTP等購自大連寶生物工程公司。麥康凱固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、Minca培養(yǎng)基、革蘭染色液等均購自當(dāng)?shù)厣锕竞突瘜W(xué)試劑有限公司。大腸桿菌O因子定型血清診斷液(O101、O9、O78、O102、O2、O38、O104、O137、O64、O15、O141)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為世紀(jì)科技(北京)有限公司；細(xì)菌生化反應(yīng)管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器PCR擴(kuò)增儀購自Biometra；電泳儀購自北京六一儀器廠；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Proteinsimple；YS100光學(xué)雙目顯微鏡購自Nikon公司。

1.4 引物的合成參考GenBank上公布的EscherichiacoliF41(M21788.1)和K99(M35282.1)菌毛基因序列設(shè)計(jì)引物：F41F:5′-GCATCAGCGGCAGTATCT-3′，F(xiàn)41R:5′-GTCCCTAGCTCAGTATTATCA CCT-3′；K99F:5′-TATTATCTTAGGTGGTATGG-3′，K99R：5′-GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC-3′；參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)牛大腸桿菌16S rRNA基因引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。以上引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 樣品的采集從河北省肅寧、定州、望都、曲陽4個(gè)地區(qū)的奶牛場采集1月齡左右腹瀉犢牛的新鮮糞便56份，置于4℃保存，24 h內(nèi)進(jìn)行大腸桿菌的分離。

1.6 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定將保存的犢牛腹瀉糞便樣品經(jīng)生理鹽水稀釋，均勻涂布于麥康凱培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)18 h；挑取單菌落接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)36 h;按1∶100 的比例將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min培養(yǎng)36 h；再按同樣的將培養(yǎng)后菌液按1∶100 的比例接種于Minca培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h[7]。取培養(yǎng)的菌液經(jīng)革蘭染色，置于1 000倍油鏡下鏡檢，觀察并記錄菌體形態(tài)、大小和染色特性。

經(jīng)麥康凱鑒別培養(yǎng)基鑒定后的陽性樣品，挑取其單菌落，置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種針蘸取菌液接種于硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖生化反應(yīng)管，35℃培養(yǎng)24～48 h，并進(jìn)行吲哚試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)，觀察反應(yīng)管的現(xiàn)象，鑒定其生化特性。

1.7 分離菌的PCR鑒定及測序鑒定

1.7.1大腸桿菌基因組DNA的提取 將1.6中分離培養(yǎng)菌液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書操作，提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃保存。

1.7.2大腸桿菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增與測序鑒定 利用牛大腸桿菌16S rRNA引物對(duì)提取的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,預(yù)期目的條帶長度約1 500 bp。PCR反應(yīng)體系為：細(xì)菌基因組DNA作為：模板1 μL，上、下引物各1 μL，Taq酶0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，滅菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃ 3 min；變性98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min,共循環(huán)30次；再延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)，純化回收后，送去生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.8 大腸桿菌優(yōu)勢血清型篩選

1.8.1大腸桿菌O抗原的制備 將分離的大腸桿菌株劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h；培養(yǎng)好的菌液裝入離心管，121℃高壓2 h[8]。取高壓后的大腸桿菌抗原于離心管中，10 000 r/min 離心2 min，棄上清。使用0.5%石炭酸生理鹽水重懸沉淀，此時(shí)液體呈渾濁黏稠狀，4℃保存[9～11]。

1.8.2大腸桿菌O抗原血清型的鑒定 結(jié)合國內(nèi)學(xué)者報(bào)道的我國部分地區(qū)奶牛場流行的致犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型類型，選出11種大腸桿菌 O因子定型血清(O101、O9、O78、O102、O2、O38、O104、O137、O64、O15、O141)分別與制備的大腸桿菌抗原進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)，鑒定大腸桿菌O抗原的血清型。取大腸桿菌O因子定型血清50 μL滴加到載玻片上，再吸取大腸桿菌抗原 50 μL于玻片上，混勻，呈硬幣厚的薄膜狀，靜置3 min。并用生理鹽水做空白對(duì)照[12-14]。觀察記錄是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，判定大腸桿菌的血清型。

1.9 大腸桿菌菌毛的鑒定對(duì)分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行DNA提取，使用合成的菌毛引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。菌毛F41的PCR反應(yīng)體系為：模板1 μL，上、下引物各1 μL；Taq酶0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，滅菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min。菌毛K99的PCR反應(yīng)體系與菌毛F41的PCR反應(yīng)體系一致；PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃ 3 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min。使用膠回收試劑盒按說明書操作對(duì)出現(xiàn)的目的條帶進(jìn)行回收，純化后的產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。

1.10 大腸桿菌致病性試驗(yàn)將分離鑒定的兼性菌毛株O101：F41：K99菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌株菌液稀釋成5個(gè)濃度，分別是1.5×106，1.5×107，1.5×108，1.5×109，1.5×1010CFU/mL，將21日齡的昆明小鼠分成6組，每組5只，1～5組為試驗(yàn)組，按照5種菌液濃度從高到低分別腹腔注射500 μL菌液；6組為空白對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水500 μL[15]。觀察并記錄小鼠5 d內(nèi)的發(fā)病和病死情況，解剖小鼠并對(duì)有病變的臟器進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

將分離鑒定的單菌毛菌株O101：F41和O101：K99菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌株菌液稀釋成4個(gè)濃度，分別是1.5×109，1.5×1010，1.5×1011，8×1011CFU/mL。將21日齡的昆明小鼠分成5組，每組5只，1～4組為試驗(yàn)組，按照4種菌液濃度從高到低分別腹腔注射500 μL；5組為空白對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水500 μL。觀察并記錄小鼠5 d內(nèi)的發(fā)病和病死情況，解剖小鼠并對(duì)有病變的臟器進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果從河北省4個(gè)地區(qū)的奶牛場采集犢牛腹瀉的新鮮糞便，經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)，56份犢牛腹瀉糞便樣品有48份培養(yǎng)基中培養(yǎng)出單菌落，將其編號(hào)為DC1-48，有8份未培養(yǎng)出單菌落。肅寧地區(qū)和定州地區(qū)奶牛場分別采集的12份犢牛糞便樣品中均培養(yǎng)出單菌落；首農(nóng)地區(qū)奶牛場18份樣品中13份培養(yǎng)出單菌落，5份未培養(yǎng)出單菌落；曲陽地區(qū)奶牛場14份樣品中11份培養(yǎng)出單菌落，3份未培養(yǎng)出單菌落。可見單個(gè)菌落為玫紅色、橢圓形，表面呈光滑、濕潤的生長狀態(tài)(圖1A)。挑取單菌落經(jīng)革蘭染色后，在1 000倍油鏡下觀察，可見分離菌為革蘭陰性短桿菌(圖1B)，符合大腸桿菌的形態(tài)特征和生長特性。

A.菌落特征；B.菌體特征

將麥康凱培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)后的48份陽性樣品培養(yǎng)成菌液后，接種于11種生化反應(yīng)管，結(jié)果可見48份菌液均不產(chǎn)生硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶，不能利用枸櫞酸鹽，在半固體瓊脂上不能擴(kuò)散生長；能使賴氨酸脫羧，但不能使鳥氨酸脫羧；能發(fā)酵山梨糖和木糖，但不能發(fā)酵側(cè)金盞花醇和棉子糖；甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陽性結(jié)果。以上反應(yīng)結(jié)果均屬于大腸桿菌的生化特性，說明48份菌液均為大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌16S rRNA基因PCR鑒定結(jié)果對(duì)分離培養(yǎng)的48份大腸桿菌菌液提取核酸后，經(jīng)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均出現(xiàn)特異性目的條帶，約為1 500 bp(圖2)，符合預(yù)期結(jié)果。

M.DL2000 DNA Marker;1～48.樣品16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 大腸桿菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果經(jīng)大腸桿菌16S rRNA基因引物PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行測序后，將測序結(jié)果與NCBI上公布的大腸桿菌16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果48株分離菌與已發(fā)表的大腸桿菌序列同源性均在97%～99.7%范圍內(nèi)，與大腸桿菌MH671460.1同源性最高(圖3)，說明分離得到的菌株均為大腸桿菌。

1～18.GenBank上發(fā)布的大腸桿菌16S rRNA基因序列；19～24.部分分離菌的基因序列

2.4 大腸桿菌優(yōu)勢血清型篩選結(jié)果河北省4個(gè)地區(qū)奶牛場48份犢牛腹瀉大腸桿菌抗原與大腸桿菌O因子定型血清經(jīng)玻板凝集試驗(yàn)鑒定，有36份菌株鑒定出O抗原血清型，12份未鑒定出血清型。其中，肅寧地區(qū)12株大腸桿菌中有6份與O101出現(xiàn)凝集，3株與O102出現(xiàn)凝集，1份與O78出現(xiàn)凝集；定州地區(qū)12株大腸桿菌中8株與O101出現(xiàn)凝集，1株與O104出現(xiàn)凝集；望都地區(qū)13株大腸桿菌，6株與O101出現(xiàn)凝集，3株與O78出現(xiàn)凝集；曲陽地區(qū)11株大腸桿菌中4株與O101出現(xiàn)凝集，2株與O102出現(xiàn)凝集，O104和O15各有1株與其出現(xiàn)凝集(表1)。綜合來看，48份大腸桿菌抗原有24份與大腸桿菌O101出現(xiàn)凝集反應(yīng)，占出現(xiàn)凝集反應(yīng)總數(shù)的2/3,表明河北省部分地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌的優(yōu)勢血清型主要為O101。

表1 犢牛腹瀉大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果

2.5 大腸桿菌菌毛鑒定結(jié)果利用大腸桿菌菌毛K99和F41基因引物對(duì)血清型為O101的24株大腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定菌毛類型(圖4A)，有6株大腸桿菌擴(kuò)增出特異性目的條帶，大小約為314 bp，與菌毛基因K99的預(yù)期條帶大小一致；有7株大腸桿菌擴(kuò)增出特異性目的條帶，約為380 bp，與菌毛基因F41的預(yù)期條帶大小一致(圖4B)，其中有1株分離菌可以擴(kuò)增出菌毛F41基因和菌毛K99基因。

M.DL1000 DNA Marker;A.菌毛K99鑒定結(jié)果；A1～A21.菌毛K99基因;B.菌毛F41鑒定結(jié)果；B1～B19.菌毛F41基因

擴(kuò)增的目的基因序列與大腸桿菌K99菌毛基因序列的同源性在94.1%～100%之間，與大腸桿菌K99菌毛MH916617.1序列同源性最高(圖5)，說明6株大腸桿菌攜帶的菌毛均為K99。其中兼性菌毛株(O101：F41：K99)擴(kuò)增的目的基因序列與FJ864678.1、JX987524.1、KR870316.1、KX461930.1、MF955843.1、MH916617.1序列同源性最高，均為99.6%。

1～8.GenBank上公布的大腸桿菌K99菌毛基因序列；9.為兼性菌毛株的K99菌毛基因擴(kuò)增序列；10,11.部分樣品的大腸桿菌K99菌毛基因擴(kuò)增序列

擴(kuò)增的目的基因序列與大腸桿菌F41菌毛基因序列的同源性在93.9%～100%之間，與大腸桿菌F41菌毛MF955845.1序列同源性最高(圖6)，說明7株大腸桿菌攜帶的菌毛均為F41。其中兼性菌毛株(O101：F41：K99)擴(kuò)增的目的基因與MF955845.1、M21788.1序列同源性最高，均為100%。

1～6.GenBank上公布的大腸桿菌菌毛F41基因序列；7.部分樣品的大腸桿菌F41菌毛基因擴(kuò)增序列;8.兼性菌毛株的F41菌毛基因擴(kuò)增序列

2.6 大腸桿菌致病性試驗(yàn)結(jié)果大腸桿菌兼性F41-K99菌毛株、F41菌毛株、K99菌毛株通過小鼠致病性試驗(yàn)后，小鼠均在攻毒后24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡小鼠的病變臟器均分離出大腸桿菌(圖7)，3種菌株最小致死劑量分別為1.5×1010,1.5×1011,8×1011CFU/mL，說明分離鑒定的3株大腸桿菌均具有較強(qiáng)的致病性。各菌株低濃度劑量組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、食欲不佳、被毛粗糙、兩眼半閉、全身顫抖、互相扎堆等癥狀,表明3株分離菌均具有致病性，其中兼性菌毛株最小致死劑量最低，致病性較強(qiáng)。

A～C.兼性菌毛株病變臟器鑒別培養(yǎng)結(jié)果;D～F.F41菌毛株病變臟器鑒別培養(yǎng)結(jié)果；G～H.K99菌毛株病變臟器鑒別培養(yǎng)結(jié)果

對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，兼性菌毛株致死小鼠可見肝臟腫大，腸道彌漫性出血、脾臟腫大，其他臟器未見異常；F41菌毛株致死小鼠肝臟發(fā)白，脾臟腫大，腸道彌漫性出血；K99菌毛株致死小鼠，可見脾臟腫大，腸道出血(圖8),表明3株分離菌均能引起組織器官的病理變化，兼性菌毛株所引起的病理變化最為嚴(yán)重。根據(jù)分離鑒定的3株菌對(duì)小鼠的最小致死量大小、各臟器病變嚴(yán)重程度進(jìn)行比較，得出兼性菌毛株毒力最強(qiáng)，其次是F41菌毛株，最后是K99菌毛株。

A1.兼性菌毛株致死小鼠各臟器情況；4.F41菌毛株致死小鼠各臟器情況;7.K99菌毛株致死小鼠各臟器情況;A2,B2,C2.肝臟;A3,B3,C3.脾臟

3 討論

近年來，我國奶牛場規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷增加，在飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差和免疫不及時(shí)等因素影響下，許多疾病也伴隨而來，危害奶牛的健康，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。于大腸桿菌的抗原種類繁多，不同地區(qū)不同牛場感染的大腸桿菌血清型也不盡相同，給犢牛大腸桿菌病的防制帶來了眾多的困擾。本次研究結(jié)果證明河北省部分地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O101，為進(jìn)一步研究和控制大腸桿菌病提供流行病學(xué)打下基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)采用血清學(xué)方法鑒別大腸桿菌的O抗原，結(jié)果河北省4個(gè)地區(qū)奶牛場有24份大腸桿菌O抗原均與大腸桿菌O101定型血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)；有10份大腸桿菌抗原分別與O102、O104、O78、O15定型血清出現(xiàn)凝集；但是也有一小部分大腸桿菌未鑒定出血清型?？赡苁怯捎诖竽c桿菌耐高溫，在121℃持續(xù)2 h也不會(huì)改變本身的抗原性，但是位于大腸桿菌細(xì)胞壁外側(cè)的決定抗原特異性的脂多糖(LPS)容易受物理或化學(xué)因素的影響而發(fā)生改變，導(dǎo)致抗原的種類無法識(shí)別[16]。也有可能由于大腸桿菌抗原種類復(fù)雜多樣，導(dǎo)致一小部分大腸桿菌抗原無法被識(shí)別。

據(jù)報(bào)道，大腸桿菌菌毛抗原是引起犢牛腹瀉的重要因素之一，菌毛K99和F41是腹瀉犢牛和羔羊中常見的2種類型，并且具有較強(qiáng)的免疫原性[17-20]。大腸桿菌和其他革蘭陰性菌都是通過菌毛與宿主細(xì)胞表面特定受體的結(jié)合而產(chǎn)生黏附作用的，所以菌毛黏附素是一類不容輕視的毒力因子。通常一種細(xì)菌只表達(dá)一種菌毛，但有些菌株可同時(shí)表達(dá)2種或更多種菌毛，但對(duì)細(xì)菌攜帶菌毛種類和毒力強(qiáng)弱關(guān)系尚不明確[21]。本試驗(yàn)分離到1株攜帶F41和K99 2種菌毛的大腸桿菌，又將其與單菌毛F41菌株和K99菌株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，根據(jù)分離鑒定的3株菌對(duì)小鼠的最小致死劑量、各臟器病變程度進(jìn)行比較，得出兼性菌毛株毒力最強(qiáng)，表明細(xì)菌攜帶菌毛種類和毒力強(qiáng)弱關(guān)系有一定的正相關(guān)性。本試驗(yàn)為下一步研制犢牛腹瀉大腸桿菌疫苗提供數(shù)據(jù)參考。