不同耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲國內(nèi)分離株耐阿苯達唑特性

羅曉平,王鵬龍,李軍燕,楊曉野*,耿萬恒,馮新港，劉 威，李 超,劉 陽,王 瑞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.中國農(nóng)業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)，是寄生于牛羊等反芻動物體內(nèi)的重要胃腸道線蟲之一，主要導致宿主貧血、水腫、衰弱及消化紊亂，對家畜造成嚴重危害，國內(nèi)已對其進行了系列研究[1-6]。國家“973”計劃“牛羊重要寄生蟲致病機制的分子基礎研發(fā)”及國家重點研發(fā)計劃“嚴重危害畜禽的寄生蟲病診斷、檢測與防控新技術(shù)”項目已將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲列為重點研究內(nèi)容，且前期許多研究結(jié)果顯示，國內(nèi)大部分地區(qū)絕大多數(shù)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲都存在對常用驅(qū)蟲藥物的耐藥性，包括伊維菌素(ivermectin，IVM)和阿苯達唑(albendazole)[7-12]。

目前，除IVM外，阿苯達唑是使用最多的一種廣譜驅(qū)蟲藥，其屬于苯并咪唑氨基甲酸酯類藥物，由于其不僅可以驅(qū)除胃腸道線蟲的成蟲和第4期幼蟲，還可以驅(qū)除絳蟲及肺線蟲的成蟲和幼蟲，在高劑量下，對大于14周齡的肝片吸血蟲也具有殺蟲效果，且該藥還是一種潛在的治療賈第蟲藥物[13-14]，因此，雖然使用起來較IVM繁瑣，但也深受農(nóng)牧民等養(yǎng)殖業(yè)主的青睞。該藥主要通過選擇性地與β-微管蛋白結(jié)合，打破微管與微管蛋白之間的平衡而發(fā)揮作用。在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中，其耐藥性產(chǎn)生主要是由于Ⅰ型β微管蛋白基因上的3個SNP造成，包括：167(T/A)、198(A/C)和200(T/A)[15-17]。對于阿苯達唑耐藥性的檢測，世界獸醫(yī)促進會推介使用糞便蟲卵減少試驗和蟲卵孵化幼蟲試驗方法進行分析[18]，同時，也有基于Ⅰ型β微管蛋白基因分子檢測的報道[19-20]。為此，本試驗通過蟲卵孵化幼蟲試驗和Ⅰ型β微管蛋白基因多態(tài)性分析方法，從表型和分子遺傳學層面，對IVM耐藥及敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲國內(nèi)分離株進行耐阿苯達唑檢測，以了解其雙重耐藥性問題，并為國內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲株對IVM耐藥的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲國內(nèi)分離株(WSHc-001、WSHc-003、WSHc-138、CYHHc-136)及對IVM敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲國內(nèi)分離株(YCHc-022)成蟲樣本，于75%酒精固定，保存在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲學實驗室；感染不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株的羊，用單獨籠具內(nèi)隔離飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院實驗動物基地家畜寄生蟲病學研究室動物房。

1.2 主要試劑阿苯達唑原粉(歐洲標準品)，購自壇墨質(zhì)檢-標準物質(zhì)中心；NCTC109培養(yǎng)基(gibco)，購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；DMSO(分析純)，購自SIGMA-ALDRICH；DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker及2×PCR Mix,均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 阿苯達唑藥液配制參照參考文獻[18，21]藥液配制方法，準確稱取阿苯達唑原粉8 mg溶于800 μL的DMSO中，得到阿苯達唑儲存液A，質(zhì)量濃度為10 g/L；然后，取100 μL阿苯達唑儲存液A，使用DMSO稀釋10倍得到阿苯達唑儲備液B，質(zhì)量濃度為1 g/L；再按照表1配制不同質(zhì)量濃度的阿苯達唑工作液C，備用。

表1 阿苯達唑工作液配制方法及培養(yǎng)液終質(zhì)量濃度

1.4 蟲卵收集對羊進行直腸采糞后，將新鮮糞便樣本置于50 mL離心管中，用0.5%甲醛溶液將離心管裝滿，并用力搖晃，以達到無氧的目的，隨后帶回實驗室。將樣本置于研缽內(nèi)，棄掉液體，加適量飽和生理鹽水后將糞便樣本研碎，再加入10倍體積的飽和生理鹽水，混勻后經(jīng)40，100目篩網(wǎng)依次過濾，在濾液中加入1/5體積的飽和蔗糖濾液，混勻后倒于大平皿內(nèi)，補充飽和生理鹽水至液面略高于平皿口，上面覆蓋一張硬塑料膜。靜置15 min后，將硬塑料膜輕輕抬起，用去離子水將膜面上的蟲卵沖入燒杯，3 000 r/min 離心漂洗3次后，對蟲卵進行鏡檢，確認無大粒雜質(zhì)后對蟲卵進行計數(shù)，并將蟲卵稀釋成400枚/mL左右的濃度。

1.5 培養(yǎng)體系配置及蟲卵計數(shù)使用24孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，每組設置8個藥物濃度及1個陰性對照組和1個陽性對照組。每孔總體積為2 mL，其中蟲卵懸浮液250 μL、不同質(zhì)量濃度阿苯達唑工作液10 μL、NCTC109培養(yǎng)基350 μL、去離子水1 390 μL。每個蟲株設2個重復，每個重復設3個平行。對孔內(nèi)蟲卵進行計數(shù)，置于27℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后再次對每孔內(nèi)未孵化的蟲卵進行計數(shù)。

1.6 蟲卵孵化幼蟲試驗結(jié)果判定對每組計數(shù)結(jié)果使用GraphPad Prism 6.0軟件中的log(agonist)vs.response--Variable slope(four parameters)方法統(tǒng)計EC50值和R2。依據(jù)參考文獻[18，21]推薦的標準，當EC50≥0.1 mg/L時，則認為備檢蟲株存在耐藥性；而EC50<0.1 mg/L時，則認為備檢蟲株對藥物敏感。

1.7 不同蟲株成蟲基因組DNA提取將保存于75%酒精中的不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲(雌、雄蟲各25條)取出，用去離子水漂洗3～5次，置于PBS溶液中浸泡過夜，之后再次用去離子水漂洗2次，用于DNA提取。所有蟲體基因組DNA提取過程均參照試劑盒說明進行。DNA提取完成后，使用核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度，質(zhì)量較好的DNA樣本用于后續(xù)研究。

1.8 Ⅰ型β微管蛋白基因的PCR擴增及測序以鑒定合格的樣本DNA為模版，用引物[22]HcPy2PCR-F(5′-GACGCATTCACTTGGAGGA-G-3′)/HcPy2PCR-R(5′Biotin-CATAGGTTGGA TTGTGAGTT-3′)擴增Ⅰ型β微管蛋白基因(385 bp)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將產(chǎn)物直接測序(雙向)。PCR反應體系25 μL：10 mmol/L 上、下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，DNA模版2 μL，無菌無酶水8.5 μL；擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，53℃ 40 s，68℃ 40 s,40個循環(huán)；68℃ 7 min。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 序列分析與結(jié)果判定將所得序列使用Lasergene 7.0軟件進行分析，人工校正，與基因庫中標準的Ⅰ型β微管蛋白基因序列比對，分析序列中第167、198、200位點單核苷酸多態(tài)性，并統(tǒng)計不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因的基因型及其頻率。依據(jù)參考文獻[23]報道的方法對結(jié)果進行判定：若1個種群中，有超過10%的個體攜帶耐藥基因型(在1個位點存在純合耐藥基因型或在2個位點位點同時存在雜合子基因型)，則認為這個種群存在耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 不同蟲株蟲卵孵化幼蟲試驗結(jié)果采用參考文獻[18]推薦的蟲卵孵化幼蟲試驗，對不同分離株耐阿苯達唑特性進行分析。結(jié)果如表2及圖1～5所示，所分離的對IVM耐藥捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株同時對阿苯達唑耐藥，且所有耐藥蟲株EC50較檢測標準0.1 mg/L要高出數(shù)倍，尤其是WSHc-001，其EC50值達到了1.4 mg/L。而所分離的對IVM敏感捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株同時對阿苯達唑不耐藥，其EC50值僅為0.07 mg/L。

表2 阿苯達唑?qū)Σ煌蛛x株EC50統(tǒng)計結(jié)果

圖1 YCHc-022株蟲卵孵化幼蟲試驗檢測結(jié)果

2.2 不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株Ⅰ型β微管蛋白基因PCR擴增結(jié)果使用針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Ⅰ型β微管蛋白基因的特異性引物，對鑒定合格樣本進行目的條帶擴增，結(jié)果如圖6所示：所有檢測樣本在瓊脂糖凝膠上均出現(xiàn)了385 bp的目的條帶，表明基因擴增成功，產(chǎn)物可進行測序，用于特異性位點的單核苷酸多態(tài)性分析。

圖2 WSHc-001株蟲卵孵化幼蟲試驗檢測結(jié)果 圖3 WSHc-003株蟲卵孵化幼蟲試驗檢測結(jié)果

圖4 WSHc-138株蟲卵孵化幼蟲試驗檢測結(jié)果 圖5 CYHHc-136株蟲卵孵化幼蟲試驗檢測結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～23.待檢樣品；C.陰性對照(滅菌蒸餾水)

2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株Ⅰ型β微管蛋白基因特異性位點SNP分析結(jié)果對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體Ⅰ型β微管蛋白基因中與阿苯達唑耐藥相關(guān)的第167、198、200位單核苷酸的多態(tài)性進行分析，結(jié)果顯示,所有蟲株中，167位點僅存在純合敏感型(TTC)；198位點存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)，狀況最為復雜；而在200位點，絕大部分僅存在純合敏感型(TTC)和雜合耐藥型(TTC/TAC)；純合耐藥型(TAC)在CYHHc-136蟲株中大量存在，而在WSHc-138蟲株的雌蟲中少量存在，且在YCHc-022蟲株中也出現(xiàn)1個。

2.3.1WSHc-001蟲株 所有樣本在167位點均為純合敏感型(TTC)；在198位點，存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)3種類型，且雌雄蟲間各自占比有所不同，其中純合耐藥型占比達到52.4%，在雌雄蟲中所占比例分別為60.9%和42.1%；而在200位點，未見純合耐藥型(TAC)(表3)，表明該蟲株具有耐藥性。

表3 WSHc-001蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點的單核苷酸多態(tài)性

2.3.2WSHc-003蟲株 所有樣本在167位點均為純合敏感型(TTC)。在198位點，存在純合敏感型(GAA)、雜合耐藥型(GCA/GAA)及純合耐藥型(GCA)3種類型；其中，純合耐藥型占比總體達到30%，在雌雄蟲中所占比例分別為27.3%和33.3%。200位點，未見純合耐藥型(TAC)(表4)，表明該蟲株具有耐藥性。

表4 WSHc-003蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點的單核苷酸多態(tài)性

2.3.3WSHc-138蟲株 所有樣本在167位點均為純合敏感型(TTC)；在198位點，純合耐藥型(GCA)占比總體達到40.9%，在雌雄蟲中所占比例分別為47.6%和34.8%；200位點，純合耐藥型(TAC)占比為4.8%，而雄蟲中未見純合耐藥型(表5)，表明其具有耐藥性。

表5 WSHc-138蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點的單核苷酸多態(tài)性

2.3.4CYHHc-136蟲株 所有樣本在167位點均為純合敏感型(TTC)；在198位點，純合耐藥型(GCA)總體占比為14.0%；200位點，純合耐藥型(TAC)總體占比達到14.0%(表6),表明該蟲株具有耐藥性。

表6 CYHHc-136蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198、200位點的單核苷酸多態(tài)性

根據(jù)198位點純合耐藥型占比，雌蟲耐藥而雄蟲不耐藥；而根據(jù)200位點純合耐藥型分析，雌蟲不耐藥而雄蟲耐藥。兩者相結(jié)合后，雌雄蟲則均耐藥。

2.3.5YCHc-022蟲株 在198位點雄蟲中有4.2%蟲體出現(xiàn)純合耐藥型(GCA)，而雌蟲中并未出現(xiàn)，總體而言，其純合耐藥型占比僅為2.17%，且200位點和167位點也均未見純合耐藥型，表明其對阿苯達唑敏感(表7)。但是，種群中出現(xiàn)了大量的單位點雜合耐藥型及個別的單位點純合耐藥型，故該蟲株存在對阿苯達唑產(chǎn)生耐藥性的風險。

表7 YCHc-022蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因167、198及200位點的單核苷酸多態(tài)性

2.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株Ⅰ型β微管蛋白基因型及其頻率分析結(jié)果對所有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株測序峰圖進行分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型β微管蛋白基因序列中存在7種基因型，包括198位點純合敏感型(GAA)及200位點純合敏感型(TTC)、198位點純合敏感型(GAA)及22位點雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點純合敏感型(GAA)及200位點純合耐藥型(TAC)、198位點雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點純合敏感型、198位點雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點純合耐藥型(GCA)及200位點雜合耐藥型(TAC/TTC)、198位點純合耐藥型(GCA)及200位點純合敏感型(TTC)(圖7～13)。對于不同分離株，除167位點所有檢測蟲體均為純合敏感型(TTC)外，各分離株198位點和200位點所含基因型也有所不同。其2個位點同時存在雜合耐藥基因型(Het-198且Het-200)所含個體數(shù)及其頻率如表8所示，對伊維菌素耐藥捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株(WSHc-001、WSHc-003、WSHc-138、CYHHc-136)而言，其種群內(nèi)基因頻率為15.9%～51.2%，表明各分離株對阿苯達唑也存在耐藥性。對雌雄蟲分別分析顯示，在4個分離株中，WSHc-001和WSHc-138雌蟲雙位點雜合耐藥型占比低于10%的臨界值；其余分離株不論雌雄，其雙位點雜合耐藥型頻率均在10%以上。對YCHc-022蟲株而言，雖然群體雙位點雜合耐藥型頻率僅有8.7%，低于10%的臨界值，顯示蟲株對阿苯達唑敏感，但其雌蟲中雙位點雜合耐藥型占比卻達到了13.6%，顯示出雌蟲對阿苯達唑的耐藥性，而雄蟲中占比僅為4.2%。

圖7 198位點純合敏感型(GAA)及200位點純合敏感型(TTC)

圖8 198位點純合敏感型(GAA)及200位點雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖9 198位點純合敏感型(GAA)及200位點純合耐藥型(TAC)

圖10 198位點雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點純合敏感型

圖11 198位點雜合耐藥型(GAA/GCA)及200位點雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖12 198位點純合耐藥型(GCA)及200位點雜合耐藥型(TAC/TTC)

圖13 198位點純合耐藥型(GCA)及200位點純合敏感型(TTC)

表8 不同蟲株Ⅰ型β微管蛋白基因2個位點同時出現(xiàn)雜合耐藥型頻率統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

對于羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病而言，常用的驅(qū)蟲藥物主要包括苯并咪唑類(阿苯達唑等)和大環(huán)內(nèi)脂類(IVM等)。據(jù)報道，國外不同地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲均對阿苯達唑產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[24-25]。國內(nèi)，林琳等[26]對福建山羊感染的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐藥性檢測結(jié)果顯示，蟲體對阿苯達唑具有一定的耐藥性；蔡葵蒸等[27]對寧夏地區(qū)16個羊場的調(diào)查結(jié)果顯示，25%養(yǎng)殖場中胃腸道線蟲對阿苯達唑存在耐藥性；額葉勒德格等[9]對內(nèi)蒙古烏審旗綿羊胃腸道線蟲耐藥性調(diào)查結(jié)果顯示，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和細頸線蟲為主的胃腸道線蟲對阿苯達唑產(chǎn)生了嚴重的耐藥性；本研究團隊前期對內(nèi)蒙古呼倫貝爾新巴爾虎右旗某牧場放牧羊的驅(qū)蟲試驗也表明，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為主的胃腸道線蟲對阿苯達唑存在耐藥性[7]。

本研究中，首先通過蟲卵孵化幼蟲試驗，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐IVM分離蟲株的耐阿苯達唑特性進行分析，不論按COLES等[18]推薦的檢測限量(EC50≥0.1 mg/L為耐藥，EC50<0.1 mg/L為敏感)，還是按參考文獻[8]給出的檢測限量(EC50≥0.08 mg/L 為耐藥，0.08 mg/L>EC50≥0.05 mg/L為疑似耐藥，EC50<0.05 mg/L為敏感)，均表明所分離到的4株耐IVM蟲株同樣耐阿苯達唑(EC50介于0.25～1.4 mg/L)，而對IVM敏感的蟲株對阿苯達唑敏感或疑似耐藥(EC50值為0.07 mg/L)。究其原因，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲耐IVM分離株來源的羊群所處地區(qū)，農(nóng)牧民都有每年定期對羊只進行全群驅(qū)蟲的習慣，如春秋2次驅(qū)蟲。更有甚者，1年中每個月都進行1次驅(qū)蟲，但所用藥物則相對單一，以IVM注射液和阿苯達唑片劑為主。而對IVM敏感捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲株分離地，則人們對驅(qū)蟲不太重視，只有當羊只消瘦且發(fā)育遲緩后，才進行個體性驅(qū)蟲，所使用的驅(qū)蟲藥也是IVM注射液和阿苯達唑片劑，但并非全群用藥。所以1個蟲株出現(xiàn)多重耐藥是可以理解的，敏感蟲株EC50值大于絕對敏感蟲株也是正常的。為此，基于包括捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在內(nèi)的羊胃腸道線蟲對常用驅(qū)蟲藥耐藥性日益凸顯的問題，應加強新型驅(qū)蟲策略的宣傳，如推廣檢測性驅(qū)蟲模式，減少盲目用藥導致的寄生蟲耐藥性的產(chǎn)生。同時，鑒于蟲體對IVM與阿苯達唑耐藥性的嚴重性，在臨床實踐中，應逐步減少上述兩類藥物的使用頻率，而更多選用其他驅(qū)蟲藥。

對不同捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株與阿苯達唑耐藥相關(guān)Ⅰ型β微管蛋白基因上特異性位點SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)所有蟲株167位點均為純合敏感型(TTC)，這與張宗澤[11]對國內(nèi)不同地區(qū)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的分析以及楊新等[20]對新疆某養(yǎng)殖場捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的檢測結(jié)果一致。據(jù)BARRERE等[23]報道，若一個種群中，有超過10%的個體攜帶耐藥基因型(在167位點存在純合耐藥基因型或在200位點存在純合耐藥基因型，或在167位點和200位點同時存在雜合子基因型)，則認為這個種群存在耐藥性。而張宗澤[11]在分析了國內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲這3個SNP后，認為國內(nèi)不同來源捻轉(zhuǎn)血矛線蟲167位點只有純合敏感型，故對于國內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲而言，對阿苯達唑的耐藥評價標準應為：一個種群中，有超過10%的個體攜帶耐藥基因型(在198位點存在純合耐藥基因型或在200位點存在純合耐藥基因型，也或在198位點和200位點同時存在雜合子基因型)。據(jù)此分析，本研究中所有對IVM耐藥的分離株種群內(nèi)均超過10%的個體攜帶198位點純合耐藥基因型(為14%～52.4%)；同時，有超過10%的個體198位點和200位點同時存在雜合子基因型(15.9%～51.2%)。在對IVM敏感的分離株中，低于10%的個體攜帶198位點純合耐藥基因型(2.17%)，同時低于10%的個體198位點和200位點同時存在雜合子基因型(8.7%)，表明所有分離株通過蟲卵孵化幼蟲試驗所得結(jié)果與分子生物學檢測結(jié)果相一致。同時，分析上述3個耐藥性SNP突變在不同蟲株中所占百分比與蟲卵孵化幼蟲試所得EC50值的相關(guān)性，可以發(fā)現(xiàn)，在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲對阿苯達唑的耐藥性檢測限量中，蔡葵蒸[8]給出的標準中含有疑似耐藥指標更為合理。當然，對上述耐藥性檢測標準還有待于進一步驗證。

本試驗結(jié)果表明，所分離的對IVM耐藥的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株同時也具有對阿苯達唑的耐藥性，即存在雙重耐藥性。而對IVM敏感的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分離株則對阿苯達唑不耐藥，但也存在對阿苯達唑產(chǎn)生耐藥性的風險。