劉欣，陳少敏，高冠峰

濰坊市人民醫(yī)院婦科，山東濰坊261041

在女性腫瘤中，宮頸癌發(fā)病率較高，高危人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接病因。近年來隨著宮頸病變篩查的普及，發(fā)病率及病死率有所下降。根據(jù)國(guó)家癌癥中心2019 年全國(guó)癌癥報(bào)告，在女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病占比6.25%，居第六位；病死率占比3.96%，居第八位，均高于子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等惡性腫瘤。根據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)2019 年癌癥統(tǒng)計(jì)，美國(guó)2019 年宮頸癌發(fā)病13 170例，死亡4 250例，宮頸癌在20～39歲女性中，病死率居第二位［1］。目前最常用的宮頸細(xì)胞學(xué)篩查存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差、容易產(chǎn)生爭(zhēng)議結(jié)果的缺點(diǎn)。高危HPV 檢測(cè)作為宮頸細(xì)胞學(xué)的補(bǔ)充，主要推薦用于＞30歲的女性人群。但HPV 檢測(cè)特異度差，且現(xiàn)行檢測(cè)方法無法準(zhǔn)確指出哪部分感染患者更易于發(fā)生宮頸癌。大量HPV 感染的婦女行陰道鏡檢查，造成了不必要的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。原癌基因的擴(kuò)增，如TERC 的擴(kuò)增是宮頸癌變的早期事件，診斷效能卓越［2］，但價(jià)格較高，從經(jīng)濟(jì)—效能比率的因素考慮尚需改進(jìn)。p16/Ki-67 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)近年來逐步被應(yīng)用于宮頸癌篩查，有較高的靈敏度和特異度，可作為宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（CIN2+）的有效篩查手段［3］。本研究對(duì)比TERC及p16/Ki-67在宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中檢測(cè)的診斷效能，從而選取更優(yōu)化的篩查策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選取2013 年1 月—2020 年12月于濰坊市人民醫(yī)院門診就診的宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)（TCT）或HPV 篩查陽性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：婦科門診就診病例以及機(jī)會(huì)性篩查的25～64 歲病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期接受過宮頸病變治療的病例；已行陰道鏡活檢或已確診宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）者。共入組篩查陽性患者51 例，患者年齡（40 ± 6.5）歲。所有病例已行TCT 檢查及HPV 檢測(cè)，并經(jīng)組織學(xué)證實(shí)和陰道鏡檢查。51 例患者中，組織學(xué)檢查證實(shí)正常4例，CIN1 級(jí) 12 例，CIN2 級(jí) 18 例，CIN3 級(jí) 14 例，鱗狀細(xì)胞癌（SCC）3例。細(xì)胞學(xué)診斷分布：無上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）7 例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞不能明確意義（ASCUS）15 例，低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）15 例，非典型鱗狀細(xì)胞傾向高度病變（ASCH）6 例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）8 例。另選取10例TCT及HPV篩查均為陰性的患者作為對(duì)照，陰道鏡活檢病理或子宮全切術(shù)后宮頸病理正常。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，宮頸CIN2+級(jí)及以上視為宮頸癌前病變，CIN1-組共計(jì)26例（包含炎癥及CIN1），CIN2+組（包含CIN2、CIN3 及SCC）共計(jì)35 例。本研究開展獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 TERC 擴(kuò)增檢測(cè) 采用熒光原位雜交（FISH）法。雙色FISH探針購自北京GP 醫(yī)療技術(shù)公司。取5 mL 剩余TCT 細(xì)胞保存液，離心后膠原酶B 溶液37 ℃消化20 min，去離子水37 ℃水浴靜置30 min。甲醇—冰醋酸固定并滴片，56 ℃烤片30 min。滴加探針混合物，75 ℃水浴鍋內(nèi)共變性5 min，42 ℃雜交16 h，67 ℃下 0.3% NP-40/0.4×SSC 溶液中洗滌，70%乙醇洗滌3 min，干燥玻片后滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚，暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀察。FISH 圖像用Olympus 熒光顯微鏡，使用Video-TesT-FISH 2.0 軟件采集。信號(hào)判讀：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞核中觀測(cè)到2 個(gè)紅色信號(hào)（TERC）和2 個(gè)綠色信號(hào)（CEP3）認(rèn)定為正常二倍體細(xì)胞。TERC 信號(hào)＞2 個(gè)，或TERC 信號(hào)和CEP 信號(hào)比值＞1，則認(rèn)定為異常細(xì)胞。觀察計(jì)數(shù)視野中的所有細(xì)胞（＞100 個(gè)），對(duì)觀察細(xì)胞中異常細(xì)胞占比進(jìn)行測(cè)算。以TERC 擴(kuò)增細(xì)胞≥5%為陽性閾值。

1.3 p16/Ki-67 表達(dá)檢測(cè) 采用細(xì)胞免疫化學(xué)法。取剩余TCT 標(biāo)本保存液混勻2 min，吸取2 mL 入沉降制片器，靜置10 min。去除上清液，拆除制片器，將玻片稍干，95%乙醇固定10 min。鼠抗人p16 INK4a 蛋白單克隆抗體、兔抗人Ki-67 單克隆抗體、DS-0001 Polymer 雙染檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將玻片在3%H2O2孵育10 min，微波爐抗原修復(fù)，封閉液封閉10 min。加入一抗混合物，濕盒孵育。加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG的二抗聚合物，濕盒孵育30 min。滴加DAB 工作液，鏡下觀察，約3 min。滴加 AP-Red 工作液，孵育 10 min，鏡下觀察。蘇木素復(fù)染，封片觀察。p16 陽性顯色為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的棕黃色，Ki-67 陽性顯色為細(xì)胞核紅色。在同一細(xì)胞中出現(xiàn)雙染提示為p16/Ki-67 陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較使用Z檢驗(yàn)，四格表資料使用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 的診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織學(xué)類型患者TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 陽性情況比較 TERC 擴(kuò)增率在CIN1-組和CIN2+組中分別為11.5%及94.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。p16 擴(kuò)增率在CIN1-組和CIN2+組中分別為42.3%及88.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Ki-67 擴(kuò)增率在 CIN1-組和 CIN2+組中分別為15.4%及82.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。p16/Ki-67 雙染陽性在CIN1-組和CIN2+組中分別為4.0%及80.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 不同組織學(xué)類型患者TCT及HPV結(jié)果、TERC擴(kuò)增、p16及Ki-67表達(dá)比較（例）

2.2 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 對(duì)于 CIN2+的診斷效能比較 見表2。TERC 檢測(cè)較TCT/HPV 檢測(cè)有較高的靈敏度和特異度（94.3% vs 80.0%，88.5% vs 61.5%，P均＜0.05）。p16/Ki-67 檢測(cè)較TCT/HPV 檢測(cè)有相似的靈敏度和較高的特異度（80.0% vs 80.0%，P＞0.05；96.2% vs 61.5%，P＜0.05）。p16/Ki-67 檢測(cè)具備與 TERC 檢測(cè)較低的靈敏度（80.0% vs 94.3%，P＜0.05），略高的特異度（96.2% vs 88.5%，P＞0.05），并有相似的準(zhǔn)確性（86.9% vs 91.8%，P＞0.05）。在各種診斷策略中，p16/Ki-67 特異度最高（96.2%），其次為 TERC（88.5%）。TERC 靈敏度最高（94.3%），其次為HPV（91.4%）。曲線下面積（AUC）最高的是TERC 檢測(cè)（AUC=0.927），其 次 為 p16/Ki-67 檢 測(cè)（AUC=0.903）。

表2 TCT及HPV結(jié)果、TERC擴(kuò)增、p16及Ki-67表達(dá)對(duì)于CIN2+的診斷效能比較［%（95%CI）］

3 討論

宮頸癌目前的篩查策略以細(xì)胞學(xué)和HPV 結(jié)合為主，存在一定局限性。細(xì)胞學(xué)診斷是主觀診斷，存在靈敏度差、可重復(fù)性差的缺點(diǎn)，對(duì)病理學(xué)醫(yī)師的要求較高。HPV 檢測(cè)作為細(xì)胞學(xué)的補(bǔ)充，靈敏度高，可以彌補(bǔ)TCT 不足，但大量HPV 陽性結(jié)果增加了陰道鏡轉(zhuǎn)診量，造成不必要的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)花費(fèi)［4］。美國(guó)陰道鏡及宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）指南建議對(duì)30 歲以上女性可實(shí)施細(xì)胞學(xué)和HPV 聯(lián)合篩查。2018年美國(guó)預(yù)防服務(wù)工作小組（USPSTF）建議指出，30～65 歲的婦女應(yīng)與其醫(yī)療保健專業(yè)人員討論哪種檢測(cè)策略最適合，表明在選擇特定策略時(shí)，偏好可能是重要的考慮因素。USPSTF 將單獨(dú)選擇HPV 檢測(cè)或聯(lián)合測(cè)試對(duì)細(xì)胞學(xué)策略的臨床意義總結(jié)如下：基于HPV 篩查的策略將避免每1 000 例篩查婦女中增加約1 例癌癥病例，與細(xì)胞學(xué)相比，改善非常小。然而，與僅行細(xì)胞學(xué)相比，基于高危HPV 檢測(cè)的策略將使婦女接受更多的檢查過程［5］。本研究中，以宮頸細(xì)胞學(xué)ASCUS+為閾值，靈敏度可達(dá)88.6%，但非典型鱗狀細(xì)胞（ASCUS 及ASC-H）的占比較高（21/51），特異度較差，對(duì)臨床的指導(dǎo)性不強(qiáng)。因此，需盡快找到可對(duì)宮頸癌前病變?cè)缙谔崾镜臉?biāo)志物。

原癌基因擴(kuò)增在高危HPV 的感染中較為常見，基因異常后引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，因此基因擴(kuò)增可能是先發(fā)于形態(tài)學(xué)改變的早期事件。在宮頸癌的相關(guān)研究中，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院牽頭的研究顯示，3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增是宮頸癌變過程中不可忽視的遺傳學(xué)改變。在3號(hào)染色體中的人類染色體端粒酶基因（TERC 基因，位于3q26.3）的異?？赡苁窃斐上?qū)m 頸 癌轉(zhuǎn)變的原 因［6］。 HESELMEYER-HADDAD等［7］通過 FISH 技術(shù)對(duì)宮頸細(xì)胞中的 hTERC 基因進(jìn)行檢測(cè)，63%的CIN2 和76%的CIN3 出現(xiàn)了hTERC基因拷貝數(shù)的增加，并且拷貝數(shù)和病情的嚴(yán)重性呈正比，能較好地預(yù)示高度病變。對(duì)研究入組患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)hTERC 基因擴(kuò)增的患者1～3 年后有40.7% 從 CIN1/2 進(jìn)展到 CIN3。ANDERSSON 等［8］亦報(bào)道了宮頸腺癌中單個(gè)細(xì)胞內(nèi)TERC 基因平均拷貝數(shù)為3.3（范圍為2.3～5.2）。通過熒光原位雜交法，運(yùn)用熒光標(biāo)記探針和樣本DNA 進(jìn)行特異度雜交，利用熒光顯微鏡可以觀察到被標(biāo)記的異常DNA。用FISH 檢測(cè)TERC 擴(kuò)增細(xì)胞比例≥5%在診斷宮頸病變方面有較高的靈敏度和特異度，可與HPV 結(jié)合用于宮頸癌篩查［2，9］。FISH 技術(shù)操作在細(xì)胞分裂間期也可實(shí)施，無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，特異度和靈敏度佳，用于臨床檢測(cè)準(zhǔn)確可靠，缺陷是費(fèi)用較高，臨床應(yīng)用受限。

p16 蛋白是CDKN2A 基因（定位于9p21）編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為16 kD 的蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)CDK4/6-CyclinD／Rb-E2F 環(huán)路起負(fù)性調(diào)控作用，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S 期，一旦p16 基因缺失、突變，則不能抑制CDK4，最終導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入惡性增殖［10］。研究證實(shí)，p16 過度表達(dá)與HPV 感染及宮頸病變密切相關(guān)［11-13］。Ki-67 為MKI67 基因（定位于10q26.2）編碼的核蛋白，在增殖期的細(xì)胞（G1、S、G2和M期）高表達(dá)。腫瘤分化的程度、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和預(yù)后均可依據(jù)Ki-67 指數(shù)進(jìn)行判斷。KRUSE 等［14］發(fā)現(xiàn)，宮頸病變由CIN1 向CIN2 和CIN3 進(jìn)展時(shí)可以參考Ki-67指標(biāo)。

p16 和Ki-67 免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測(cè)已常規(guī)用于宮頸病變的組織學(xué)診斷。我國(guó)《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》指出，p16和Ki-67可用于鑒別高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，以及不成熟化生、修復(fù)性改變等［15］。免疫組織化學(xué)法主要用于鑒別診斷，而免疫細(xì)胞化學(xué)可將鑒別診斷前移到篩查環(huán)節(jié)，有助于宮頸病變的診斷，避免不必要的陰道鏡檢查和活檢。近年來，p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染色已逐漸開始用于宮頸病變的臨床診斷。IKENBERG等［16］報(bào)道了多中心 ASC-US 及 LSIL 基礎(chǔ)標(biāo)志物研究（PALMS）的結(jié)果，選取了5個(gè)歐洲國(guó)家的27 349例宮頸癌篩查者進(jìn)行了宮頸細(xì)胞學(xué)、HPV、p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在所有年齡組中，宮頸p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染比宮頸細(xì)胞學(xué)涂片診斷CIN2+的靈敏度更高，而特異度相似。特別是在HPV 感染率高、檢測(cè)特異度差的青年女性組，p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染在宮頸癌篩查中有著高度靈敏度和良好的特異度。EL-ZEIN 等［17］報(bào)道了通過免疫染色試驗(yàn)確定上皮內(nèi)瘤變的篩查分診研究（STAIN-IT）的結(jié)果，從1 158例常規(guī)TCT、HPV 和活檢結(jié)果有效的標(biāo)本中隨機(jī)選取492 例宮頸標(biāo)本，進(jìn)行回顧性p16/Ki-67 雙染色細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雙染色細(xì)胞學(xué)陽性率隨組織學(xué)嚴(yán)重程度的增加而增加，單純雙染色細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)CIN2+的診斷靈敏度低于HPV 檢測(cè)，特異度高于HPV檢測(cè)。李雨聰?shù)龋?8］研究統(tǒng)計(jì)，p16/Ki-67細(xì)胞學(xué)雙染對(duì)宮頸癌前病變?cè)\斷有較高的靈敏度及特異度，與本研究相符。周小會(huì)等［3］對(duì)中外12篇文獻(xiàn)，累計(jì) 3 696 例患者進(jìn)行了 Meta 分析，p16/Ki-67 細(xì)胞學(xué)雙染檢測(cè)診斷CIN2+的合并靈敏度為88%、合并特異度為64%，認(rèn)為其靈敏度中等，而特異度較高，有助于對(duì)宮頸癌篩查異?；颊叩脑\斷。p16/Ki-67 雙染對(duì)宮頸病變預(yù)后的影響亦有相關(guān)研究，CLARKE等［19］發(fā)現(xiàn)，在 HPV 陽性患者中，雙染陽性導(dǎo)致 5 年CIN2+發(fā)生率顯著升高，而陰性者發(fā)病率明顯下降，認(rèn)為p16/Ki-67 雙染檢測(cè)在5 年內(nèi)可提供更好的長(zhǎng)效風(fēng)險(xiǎn)分層管理，雙染陰性者可適當(dāng)延長(zhǎng)篩查間隔。

p16/Ki-67二者結(jié)合在宮頸細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用，可有效識(shí)別增殖細(xì)胞，有助于識(shí)別形態(tài)不典型的異常細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，指導(dǎo)診斷。但多需要專用制片儀器，如CINtec，價(jià)格昂貴，臨床使用受限。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，簡(jiǎn)化的手工制片技巧可使試驗(yàn)步驟更短，達(dá)到近似效果。本研究中，p16/Ki-67 檢測(cè)和TERC 檢測(cè)的診斷效能均優(yōu)于傳統(tǒng)的TCT/HPV 檢測(cè)，其中p16/Ki-67 檢測(cè)比TERC 靈敏度略低，但卻有較高的特異度和相似的準(zhǔn)確性，適合于CIN1-和CIN2+的鑒別診斷，指導(dǎo)異常細(xì)胞學(xué)結(jié)果的陰道鏡轉(zhuǎn)診，尤其是ASCUS 的轉(zhuǎn)診。由于TERC 檢測(cè)費(fèi)用較高，且前期已針對(duì)TERC進(jìn)行過大樣本的篩查病例研究［2］，故本研究病例選擇以CIN 病例為主，因此病例數(shù)偏少，以后將爭(zhēng)取繼續(xù)進(jìn)行較大樣本的研究。p16/Ki-67 細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)靈敏度和特異度均較高，有良好的診斷效能，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，是一種更適合廣泛開展的宮頸病變?cè)\斷方法。