李 澤,邱 磊

作為世界六大蒸餾酒之一,中國白酒歷史悠久,是中國傳統(tǒng)文化的象征,人們最常見、常喝的的是濃、醬、清三種香型的白酒,其中又以濃香型白酒的產(chǎn)量最高,消費量最大。濃香型白酒具有窖香濃郁,香味協(xié)調(diào),入口甜,落口綿,尾凈余長等特點,是用以高粱為主的多種作物原料,采用混蒸續(xù)渣的工藝發(fā)酵而成。

中國濃香型白酒工藝是一種典型的東方固態(tài)發(fā)酵工藝,白酒的發(fā)酵是一個在開放的環(huán)境中進行的,由多種微生物及酶共同作用的復(fù)雜的過程。其微生物主要來源于大曲、周圍環(huán)境及窖泥和黃水。因此,在整個生產(chǎn)過程中,白酒的揮發(fā)性風(fēng)味特征都受到來自原料和環(huán)境的微生物區(qū)系的影響。Pang等人在對清香型白酒原料預(yù)處理的微生物區(qū)系研究中發(fā)現(xiàn),在浸泡結(jié)束時,畢赤酵母屬、絲狀念珠菌屬和假絲酵母屬與大多數(shù)風(fēng)味有強正相關(guān)性,其中,擬威爾嗜殺酵母(Cyberlindnera)與大量酯類物質(zhì)的形成密切相關(guān),并且這些相關(guān)性的影響一直到白酒發(fā)酵后期還在發(fā)揮作用[1]。大曲是白酒固態(tài)發(fā)酵的液化劑和糖化劑,來自大曲的微生物區(qū)系是白酒發(fā)酵的重要驅(qū)動力,大曲生產(chǎn)溫度的變化會促進微生物結(jié)構(gòu)的演變[2]。沈毅等對醬香型大曲中的優(yōu)勢細菌屬做了鑒定,發(fā)現(xiàn)泛菌屬(Pantoea)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)和克羅彭施泰特氏菌屬(Kroppenstedtia),其中泛菌屬是一種重要的代謝和發(fā)酵的化能異養(yǎng)菌,也是多種大曲制作中的主要菌群[3]。除了來自原料和大曲中的微生物區(qū)系會為發(fā)酵酒醅提供復(fù)雜的微生物菌群,在窖池發(fā)酵階段,窖池窖泥也是豐富微生物結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵來源。目前對于窖泥微生物的研究已經(jīng)較為完善,其中,Chen等人在對窖底窖泥和窖壁窖泥中的細菌區(qū)系進行比較研究時發(fā)現(xiàn),無論是窖壁泥還是窖底泥,厚壁菌門(Firmicutes)都是優(yōu)勢菌群,其豐度大于70%,緊接著是廣古菌門(Euryarchaeota),擬桿菌門(Bacteroidetes),互養(yǎng)菌門(Synergistetes),放線菌門(Actinobacteria)和放線菌門(Actinobacteria),另外,線性判別分析效應(yīng)大小(LEfSe)分析表明,乳酸菌在窖底泥中的相對豐度顯著高于窖壁泥,典型對應(yīng)分析(CCA)也表明窖泥中的細菌群落與速效磷含量和pH顯著相關(guān)[4]；孟雅靜等人對新老窖池的池壁泥和池底泥進行了真核菌群的結(jié)構(gòu)分析,說明了老窖池底泥真菌含量非常少,新老池壁泥真菌組成較為相似[5]； Zhang等人也對濃香型白酒的老窖池和新窖池窖底泥的原核群落結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行了調(diào)查研究,認為無論新老窖池,窖底泥在垂直深度有組成差異,但水平位置無差異,并且冗余分析(RDA)闡明了乳酸(LA)、pH和可溶性Ca2+是最重要的環(huán)境因子,也是窖底泥微生物區(qū)系生長的最關(guān)鍵條件[6]。

盡管已有部分研究闡明了堆積酒醅發(fā)酵時期微生物的演替過程,指出目前濃香型酒醅中的優(yōu)勢菌群有乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)及片球菌屬(Pediococcus)等[7],但因地理位置差異等原因,不同濃香型白酒的風(fēng)味和微生物區(qū)系差異較大。本研究利用高通量測序手段,對山東百脈泉酒業(yè)有限公司濃香型白酒整個發(fā)酵過程中的酒醅微生物群落的α-多樣性、β-多樣性進行了探究,以期揭示造成白酒的風(fēng)味物質(zhì)豐富的微生物群落的演替關(guān)系,為濃香型酒醅發(fā)酵工藝的改進提供理論基礎(chǔ),促進工藝革新。

1 材料與方法

1.1 酒醅樣本

選取連續(xù)正常生產(chǎn)20年左右的窖池,50 d發(fā)酵周期間隔取樣(第0、5、10、20、30、40、45、50 d),在窖池的上層(距窖頂0.5 m)、中層(距窖底1.5 m)、下層(距窖底0.5 m)酒醅按對角線兩點及中間點三點各取樣300 g后混合作為代表樣品,將代表樣品平均分為兩份,分別裝入預(yù)先準備好的無菌袋,用于高通量測序。本實驗總共選擇酒醅代表樣本24個,采樣后迅速置于實驗室-80 ℃冰箱中保存。

1.2 儀器與試劑

Miseq-PE-250高通量測序儀,Illumina公司(美國)；高速冷凍離心機,賽多利斯公司(德國)；-80 ℃冰箱,賽默飛世爾公司(中國)。

FastDNA Spin Kit for Soil,聯(lián)立信生物技術(shù)有限公司(北京)；引物,生工生物有限公司(上海)；高通量測序試劑,Roche公司(美國)；Buffer、Mgcl2、Taq酶、Marker及色譜標(biāo)準品等試劑均購自索萊寶科技有限公司(北京)。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取和測序

參照提取說明書,用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒提取酒醅樣品的總DNA；用分光光度計測量260 nm處的吸光度來定量DNA濃度,用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定純度。

根據(jù)王艷麗等人對16SrRNA測序區(qū)V3-V4和V4測序?qū)颖救郝溲萏娴挠绊慬8],為了得到更多的OTUs,本研究選用通用引物520F(5’-AYT GG G YDT AAA GNG-3’)和802R(5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’)擴增16SrRNA基因的V4區(qū)。PCR擴增、上機測序及測序文庫的構(gòu)建均委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)處理

采用QIIME管道(1.8.0版)軟件對原始數(shù)據(jù)進行處理。篩選出質(zhì)量較差的序列,然后用UCHIME方法檢測并剔除掉嵌合序列,得到有效序列；之后,將有效序列以97%的同源性聚類為可操作分類單元(OTUs),通過BLAST搜索Silva數(shù)據(jù)庫V119提取并注釋每個OTU的代表性序列。記錄每個OTU的豐度和這些OTU的分類,丟棄樣本中包含的總序列少于0.001%的OTU。利用QIIME計算群落的α-多樣性,如Coverage指數(shù),Chao1指數(shù),Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)等。樣本的β-多樣性分析用來比較不同酒醅樣品的微生物群落組成。Graphpad 5被用來繪制門和屬的含量條形圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 樣本序列的有效性分析

在經(jīng)過QIIME管道篩選后,24個酒醅樣本共得到1 735 298條有效序列,每個樣品測序深度平均達到72 304條。稀疏曲線用來反映分類學(xué)的完成程度,說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[9]。由圖1可見,當(dāng)測序深度超過30 000條時,所有曲線趨于飽和狀態(tài),表明本次酒醅樣品鑒定出的序列準確有效,基于有效序列的α-和β-多樣性可以較好地反映酒醅微生物群落信息。

2.2 微生物群落的α-多樣性分析

基于樣本有效序列的α-多樣性分析可以反映生態(tài)系統(tǒng)群落的物種多樣性和豐富度,常以樣本覆蓋率(Coverage),Shannon,Ace,Chao1和Simpson等指數(shù)來評價數(shù)據(jù)結(jié)果[10]。其中,Coverage指示測序深度是否可以代表樣本中所有微生物群落,其值越接近于1,則表示測得的有效序列越能反映整個微生物群落的真實情況；Shannon和Simpson指數(shù)都被用來估算樣品中微生物群落的物種多樣性,Shannon指數(shù)越大,代表群落多樣性越高,Simpson指數(shù)則相反；Ace和Chao1指數(shù)則被用來反映樣本的豐富度,估計物種的總數(shù),值越大,說明樣本的豐度越大。表1反映了隨著酒醅發(fā)酵時長增加,α-多樣性指數(shù)的變化情況。

如表1所示,在窖池酒醅上中下三層總共24個酒醅樣本中,樣本覆蓋率均大于90.0%,表明所選樣本的有效序列的測序深度較高,可以反應(yīng)整個微生物群落的真實情況。從群落演替的角度來看,各層酒醅中的OTU數(shù)量整體上變化規(guī)律是一致的,即整體呈下降趨勢,對不同層的酒醅而言,每個發(fā)酵階段大體以下層酒醅OTU數(shù)量最高,中層酒醅略高于上層酒醅。對于群落的物種多樣性來說,同層酒醅的Shannon指數(shù)隨發(fā)酵時間大體呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢,這可能是因為隨著發(fā)酵的進行,不斷有微生物加入酒醅發(fā)酵,導(dǎo)致物種多樣性升高,而當(dāng)酒醅發(fā)酵進入中后期之后,乙醇和乳酸、乙酸等物質(zhì)的含量上升,許多不耐酒精和酸的微生物隨之消亡,導(dǎo)致多樣性降低；而對于不同層酒醅,相同發(fā)酵天數(shù)的樣本的Shannon指數(shù)以下層酒醅最高,其次是中層酒醅、上層酒醅,這是因為上層酒醅大多暴露于空氣中,收集到的微生物多數(shù)來自裸露環(huán)境,而中層酒醅會有部分來自窖池壁泥的微生物參與發(fā)酵,下層酒醅的發(fā)酵微生物除了來自窖池壁泥和窖池底泥,黃水也是一大重要來源。物種多樣性的變化趨勢也可以從Simpson指數(shù)的變化大體讀出,值得注意的是,因為算法的不同,Simpson指數(shù)最大值不會超過1,且值越小,代表物種多樣性越高。對于群落的物種豐度來說,Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)是衡量物種種類多少的重要指標(biāo)。同層酒醅在發(fā)酵0～20 d時物種豐度呈現(xiàn)上升趨勢,在30 d之后即下降,變化幅度較大,也暗示了發(fā)酵過程中微生物物種的變化較為明顯；而在不同層酒醅中差異較小。

圖1 樣本稀釋曲線

表1 酒醅樣本α-多樣性指數(shù)

因此,利用α-多樣性分析手段對高通量測序的有效序列的OTUs進行研究,可以監(jiān)測濃香型酒醅在窖池發(fā)酵過程中的微生物群落多樣性和物種豐富度,掌握酒醅發(fā)酵的微生物群落演替規(guī)律。分析結(jié)果表明,對于同層酒醅,隨發(fā)酵時間的變化,物種多樣性和豐富度都呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,而對不同層酒醅而言,發(fā)酵時間一定,物種多樣性有較大差異,而物種豐富度差異不大。

2.3 微生物菌群結(jié)構(gòu)組成

2.3.1 細菌菌群門水平結(jié)構(gòu)組成

結(jié)合圖2可以看到,在門水平上,共在24份樣品中檢測到5種相對豐度大于1%的菌門,包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍細菌門,另外如綠彎菌門,酸桿菌門,廣古菌門等相對豐度小于1%的菌門,在圖中被歸類為其他菌門。從圖中可以看出,在同層酒醅的發(fā)酵初期,厚壁菌門和變形菌門相對豐度較高,但隨著發(fā)酵時間延長,厚壁菌門的比例迅速升高,并在中后期趨于穩(wěn)定,成為絕對優(yōu)勢菌群；變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍細菌門相對豐度隨發(fā)酵時間比例迅速下降,并在中后期豐度小于1%。相同發(fā)酵時間,不同酒醅中細菌菌群的相對豐度差異不大。

2.3.2 細菌菌群屬水平結(jié)構(gòu)組成

由圖3可知,在24個樣本中總共檢測到被鑒定出的相對豐度大于1%的細菌菌屬10個,另外相對豐度不足1%的和未被鑒定出的菌屬被歸類于其他菌屬。10個優(yōu)勢菌屬分別為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、梭菌屬、醋桿菌屬、鏈霉菌屬、叢毛單胞菌屬、片球菌屬、瘤胃球菌屬、克羅彭斯特菌屬。在不同層酒醅中,各優(yōu)勢菌屬所占比例有波動,但總體差距不大；在同層酒醅中,發(fā)酵前期以芽孢桿菌為主要優(yōu)勢菌群,中后期以乳桿菌為絕對優(yōu)勢菌群,未鑒定菌群及其他菌屬也占據(jù)相當(dāng)比例。乳酸菌是存在于酒醅發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌種,主要來自于片球菌屬和乳桿菌屬,其主要功能是發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。作為白酒發(fā)酵中的一種重要風(fēng)味物質(zhì),乳酸不僅可以減少白酒的刺激感,增加酒體的醇厚感,它還可以與乙醇反應(yīng)生成乳酸乙酯[11]。乳酸乙酯能增加酒體的醇甜感,是濃香型白酒的主要香味物質(zhì)。發(fā)酵前期的芽孢桿菌可以分泌多種水解酶,有效利用大曲和酒醅等原料的利用率,為提升白酒風(fēng)味發(fā)揮重要作用。魏斯氏菌也是乳酸菌的一種,對于白酒中的多種有機酸、酯類及短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的合成有重要作用,在前中期豐度較高,這可能是因為它來自大曲,在酒醅發(fā)酵過程中逐漸減少[12]。梭菌屬中的微生物能夠?qū)⒌矸邸⒌鞍踪|(zhì)和嘌呤等有機物分解為丁酸、己酸等有機酸,醇類、CO2/H2等物質(zhì),豐富濃香型白酒的風(fēng)格[13]。醋桿菌屬能夠發(fā)酵產(chǎn)生己酸、乳酸、丁酸等風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì),鏈霉菌屬能夠產(chǎn)出淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶等水解酶,有利于酒精度和出酒率的提高,兩種菌屬均為酒醅發(fā)酵過程中的重要微生物。叢毛單胞菌屬和瘤胃球菌屬中的微生物可以降解發(fā)酵谷物中的原料,為其他微生物的生長提供碳源,也可以參與有機酸的形成[14]?？肆_彭斯特菌屬也是濃香型酒醅發(fā)酵過程中的重要的產(chǎn)酯微生物[15]。

2.4 總結(jié)

作為世界六大蒸餾酒之一,中國白酒在世界上享譽盛名。中國濃香型白酒的釀造過程是由多種微生物共同推動的,這些微生物主要以細菌為主,細菌會產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,這些風(fēng)味物質(zhì)組成濃香型白酒協(xié)調(diào)、醇厚的風(fēng)味。本研究發(fā)現(xiàn),在上、中、下三個方位的濃香型發(fā)酵酒醅中,優(yōu)勢菌屬有乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、梭菌屬、醋桿菌屬、鏈霉菌屬、叢毛單胞菌屬、片球菌屬、瘤胃球菌屬、克羅彭斯特菌屬。來自各菌屬的多種微生物如乳酸菌、芽孢桿菌、魏斯氏菌、醋桿菌可以產(chǎn)生乳酸、乙酸、丁酸等物質(zhì),可以與醇類物質(zhì)生成多種酯類物質(zhì),極大地豐富濃香型白酒的風(fēng)味風(fēng)格。