于召龍　田紀偉

[摘要]多西環(huán)素作為半合成抗生素，因其吸收快、抗菌譜廣、不良反應(yīng)少等優(yōu)點在臨床上應(yīng)用較廣。在對多西環(huán)素的研究中發(fā)現(xiàn)，其不僅有抑菌作用，而且可能通過抑制炎癥因子、信號通路以及基質(zhì)金屬蛋白酶等機制，在組織再生、修復(fù)，延緩組織退變等方面具有重要作用。本文擬對多西環(huán)素的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性以及對基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制作用作一綜述。

[關(guān)鍵詞]多西環(huán)素;基質(zhì)金屬蛋白酶;金屬離子;炎癥反應(yīng);組織修復(fù)

[中圖分類號] R681.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（c）-0028-04

[Abstract] As a semi-synthetic antibiotic， Doxycycline has been widely used in the clinic due to its advantages of fast absorption， broad antibacterial spectrum and fewer adverse reactions. In the study of Doxycycline， it has been found that Doxycycline not only has antibacterial effect， but also may play an important role in tissue regeneration， repair and delaying the degenerative process by inhibiting inflammatory factors， signaling pathways and activity of matrix metalloproteinases. This paper reviews the structure and biological characteristics of Doxycycline and its inhibitory effect on matrix metalloproteinases.

[Key words] Doxycycline; Matrix metalloproteinases; Mental ions; Inflammatory reaction; Tissue recovery

多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）是由土霉素合成的廣譜類抗生素，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，其可用于治療如革蘭陽性菌、革蘭陰性菌等多種細菌感染，機制主要是通過干擾敏感菌的蛋白質(zhì)合成[1]。隨著對DOX的深入研究，發(fā)現(xiàn)其還具有抗寄生蟲[2]、抗炎[3]以及在血管、骨骼等組織中抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性的作用[4-6]。

Gross等[7]在1962年時首次發(fā)現(xiàn)間質(zhì)膠原酶（MMP-1），目前已發(fā)現(xiàn)28種MMPs。MMPs是一類活性依賴于Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，主要由巨噬細胞、中性粒細胞、結(jié)締組織細胞以及腫瘤細胞等合成分泌。在刺激因子作用下，如炎性因子白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，MMPs產(chǎn)生增多，并進入細胞外基質(zhì)（ECM）以促進ECM的降解。根據(jù)MMPs作用底物的不同，可分為以下幾種酶。①膠原酶：MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18，主要水解纖維類膠原;②明膠酶：MMP-2、MMP-9，主要水解變性膠原及基膜的主要成分;③間質(zhì)溶解酶：MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-12，可水解Ⅳ型膠原、蛋白聚糖等;④膜型MMPs：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25;⑤基質(zhì)溶解酶：MMP-7、MMP-26;⑥其他[8]。在生理狀態(tài)下，MMPs可參與胚胎的形成、炎癥細胞轉(zhuǎn)移、傷口愈合、血管生成等;在病理狀態(tài)下，其可在動脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊柱退行性病變等疾病中發(fā)揮作用。

1 DOX的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性

DOX，又名強力霉素、脫氧土霉素等，分子式為C22H24N2O8，結(jié)構(gòu)式[9]見圖1，其外觀為黃色晶狀粉末，易溶于水或甲醇。DOX為半合成廣譜抗生素，抗菌活性較強，對于金黃色葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌、沙門菌、布氏桿菌以及衣原體、支原體等均有抑制作用。在細菌增殖過程中，DOX被認為是通過與核糖體的16S rRNA 3′末端結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，進一步阻止tRNA與RNA-30S細菌核糖體亞基結(jié)合[10]，由于上述作用，細菌蛋白質(zhì)合成的起始被阻斷，從而發(fā)揮抑菌作用。

DOX可在體內(nèi)迅速被吸收，并在短時間內(nèi)分布到全身大部分組織器官，其半衰期約為16.33 h，經(jīng)肝臟代謝后，通過膽汁進入消化道排出體外。DOX在四環(huán)素類藥物中副作用相對較小，常見的有藥物肌肉注射給藥時的局部刺激、牙釉質(zhì)發(fā)育不全（主要針對8歲以下兒童）、胃腸道的刺激以及二重感染等。

2 DOX對MMPs的抑制作用

近年來，除對DOX的抗菌作用的研究外，有文獻報道，DOX在抗炎[3]、抑制牙周炎[6]、促進血管[4]、肌肉[11]、神經(jīng)組織修復(fù)[12]、治療腫瘤[13]、延緩骨關(guān)節(jié)[14]及椎間盤退變[15]等均可發(fā)揮相應(yīng)作用，可能與DOX對MMPs的抑制作用有關(guān)。

MMPs由多結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N端存在疏水信號肽序列;前肽區(qū)，保守序列PRCGV/NPD主要作用是保持酶原的穩(wěn)定性;催化活性域，有Zn2+結(jié)合位點，可促進酶的催化作用，Ca2+主要參與酶活性的激活;而在C末端區(qū)，與酶的底物識別及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）結(jié)合有關(guān)。MMP的活化過程，是將MMPs的前肽位移，Zn2+活性中心暴露后，底物進入該疏水區(qū)域被催化降解。MMPs抑制劑-TIMP，其N端功能區(qū)與MMPs Zn2+活性中心以非共價形式結(jié)合而抑制MMPs的水解作用。

隨著對MMPs參與病理過程的不斷研究，其已成為治療某些疾病的藥物作用靶點。而其抑制劑，如四環(huán)素、氯己定、銨類化合物等[16]，也在實驗研究中引起諸多學(xué)者的重視。有研究報道，四環(huán)素（如DOX）對MMPs有高效的抑制作用。

2.1 DOX通過螯合金屬離子，如Zn2+、Ca2+，以抑制MMPs發(fā)揮功能

Zn2+對于MMPs的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及酶的活性至關(guān)重要，有文獻報道，乙二胺四乙酸（EDTA）可螯合Zn2+、Ca2+，1，10-二氮雜菲可螯合Zn2+，可使MMPs失去酶的催化活性[17]。Ryan等[18]通過對糖尿病大鼠模型的皮膚組織研究發(fā)現(xiàn)，40 μM的DOX與Zn2+螯合可抑制MMP-8活性，隨著加入Zn2+的濃度增加（5 μM），DOX的抑制作用減弱，DOX對MMP-13也存在類似的效應(yīng)，通過MMP-8/-13的抑制作用可以促進皮膚組織的愈合，但是對MMP-1的抑制作用相對較弱。也有研究指出，DOX可以螯合Zn2+從而抑制MMP-2/-9的水解作用[19]。在軟骨細胞內(nèi)，DOX通過對MMPs的抑制，減緩Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的降解作用，關(guān)節(jié)內(nèi)注射DOX對骨關(guān)節(jié)炎有一定的修復(fù)作用[14]。

2.2 DOX可抑制炎癥因子介導(dǎo)的MMPs表達

炎性因子在炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮多種作用，如白介素-17（IL-17），是炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可通過促進釋放前炎性因子以及后續(xù)激活多條信號通路，如JAK/STAT、NF-κB、MAPKs（ERK1/2、p38）等，以放大炎癥反應(yīng)[20]。在肌肉相關(guān)疾病中，如多發(fā)性肌炎、皮肌炎，MMP-2/-9參與肌肉的重建，其中，MMP-2多持續(xù)表達，而MMP-9在前炎性因子刺激下，可表達或呈激活狀態(tài)[21-22]。Obradovic等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，DOX可以抑制IL-17介導(dǎo)的MMP-9的表達以及ERK1/2信號通路的激活，而且他認為，5 μg/ml（11 μM）DOX可促進肌管增生，這對于肌肉的重建與修復(fù)具有重要意義。Pereira等[24]通過對杜氏肌營養(yǎng)不良癥的研究，指出DOX對于MMP-9及TNF-α有抑制作用。多種炎癥因子（如IL-1、TNF-α）參與椎間盤退變，并且MMPs加速ECM降解。張海飛等[25]在椎間盤髓核細胞的實驗中加入DOX后，MMP-13及Ⅱ型膠原蛋白水平增高，他認為這與DOX抑制ERK1/2、JNK的磷酸化有關(guān)。但是，在一項對長期慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，DOX對于炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、炎性標志物（C-反應(yīng)蛋白）以及MMP-8無明顯抑制作用[26]。

2.3 DOX可降低一氧化氮（NO）介導(dǎo)的MMPs活性

NO作為信號分子在機體內(nèi)廣泛存在，并且參與多種生理活動（如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等）的調(diào)節(jié)機制，有研究者認為，NO可使pMMP-9催化活性中心Zn2+結(jié)合位點暴露，從而激活MMP-9活性[27]。O′Sullivan等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)，當NO水平在10 μM時，可能促進MMP-9的基因表達及活性增強，而當NO維持在100～500 μM水平時可能會起到相反作用。DOX可以降低因低水平NO引起的MMP-2/-9的活性增強[29]。但是，目前尚無確切證據(jù)證明DOX可通過調(diào)節(jié)NO水平以抑制MMPs發(fā)揮功能。

DOX對MMPs抑制作用較為廣泛，其中對MMP-1/-2/-7/-8/-9/-12/-13均有不同程度的抑制作用[30]，但是因為不同組織、器官，其細胞分布類型、外界刺激的形式、細胞微環(huán)境改變的差異以及MMPs種類繁多，因此，MMPs常呈差異性表達或多種類型同時表達。DOX可以通過多種機制抑制MMPs的水解作用，而且DOX在氧化應(yīng)激以及細胞凋亡等方面也發(fā)揮不同的作用[31]，目前DOX對MMPs的作用機制有待進一步深入研究。

3總結(jié)

隨著對DOX以及MMPs研究的廣泛和深入，在機體不同組織器官，均發(fā)現(xiàn)DOX除抑制細菌的作用，而且對MMPs也具有較強的抑制作用。在病理狀態(tài)下，MMPs的高表達對于組織、器官可能產(chǎn)生損害作用或者加速組織、器官的退變。因此，通過DOX抑制MMPs作用的研究，MMPs可能會成為治療某些疾病的藥物作用靶點，這對于組織修復(fù)及延緩疾病進展具有重要意義。

[參考文獻]

[1]Bernatová S，Samek O，Pilát Z，et al.Following the mechanisms of bacteriostatic versus bactericidal action using Raman spectroscopy[J].Molecules，2013，18（11）：13 188-13 199.

[2]Hoerauf A，Mand S，F(xiàn)ischer K，et al.Doxycycline as a novel strategy against bancroftian filariasis-depletion of Wolbachia endosymbionts from Wuchereria bancrofti and stop of microfilaria production[J].Med Microbiol Immunol，2003，192（4）：211-216.

[3]Valentín S，Morales A，Sánchez JL，et al.Safety and efficacy of doxycycline in the treatment of rosacea[J].Clin Cosmet Investig Dermatol，2009，2：129-140.

[4]Zehtabi F，Ispas-Szabo P，Djerir D，et al.Chitosan-doxycycline hydrogel：An MMP inhibitor/sclerosing embolizing agent as a new approach to endoleak prevention and treatment after endovascular aneurysm repair[J].Acta Biomater，2017，64（12）：94-105.

[5]Radhakrishnan J，Subramanian A，Krishnan UM，et al.Injectable and 3D bioprinted polysaccharide hydrogels：from cartilage to osteochondral tissue engineering[J].Biomacromolecules，2016，18（1）：1-26.

[6]Zheng P，Chen H.Evaluate the effect of different mmps inhibitors on adhesive physical properties of dental adhesives，bond strength and mmp substarte activity[J].Sci Rep，2017，7（1）：4975.

[7]Gross J，Lapiere CM.Collagenolytic activity in amphibian tissues：a tissue culture assay[J].Proc Natl Acad Sci USA，1962，48（6）：1014-1022.

[8]Gusman H，Santana RB，Zehnder M.Matrix metalloproteinase levels and gelatinolytic activity in clinically healthy and inflamed human dental pulps[J].Eur J Oral Sci，2002，110（5）：353-357.

[9]DrugBank 5.1.2：Doxycycline.Drug created on June 13，2005.Wed.27 Feb 2019.https：//www.drugbank.ca/drugs/DB00254.

[10]Chukwudi CU.rRNA binding sites and the molecular mechanism of action of the tetracyclines[J].Antimicrob Agents Chemother，2016，60（8）：4433-4441.

[11]Nguyen QT，Norelli JB，Graver A，et al.Therapeutic effects of Doxycycline on the quality of repaired and unrepaired achilles tendons[J].Am J Sports Med，2017，45（12）：2872-2881.

[12]Shakhbazau A，Mohanty C，Shcharbin D，et al.Doxycycline-regulated GDNF expression promotes axonal regeneration and functional recovery in transected peripheral nerve[J].J Control Release，2013，172（3）：841-851.

[13]Miladi I，Vivier M，Dauplat MM，et al.Doxycycline and its quaternary ammonium derivative for adjuvant therapies of chondrosarcoma[J].Cancer Chemother Pharmacol，2017，80（3）：517-526.

[14]Lu HT，Sheu MT，Lin YF，et al.Injectable hyaluronic-acid-doxycycline hydrogel therapy in experimental rabbit osteoarthritis[J].BMC Vet Res，2013，9（1）：68.

[15]蘆磊磊，沈憶新，范志海，等.多西環(huán)素在兔椎間盤退變中的作用[J].江蘇醫(yī)藥，2013，39（12）：1394-1397，1489.

[16]Perdigao J，Reis A，Loguercio AD.Dentin adhesion and MMPs：a comprehensive review[J].J Esthet Restor Dent，2013，25（4）：219-241.

[17]Lovejoy B，Cleasby A，Hassell AM，et al.Structure of the catalytic domain of fibroblast collagenase complexed with an inhibitor[J].Science，1994，263（5145）：375-377.

[18]Ryan ME，Usman A，Ramamurthy NS，et al.Excessive matrix metalloproteinase activity in diabetes：inhibition by tetracycline analogues with zinc reactivity[J].Curr Med Chem，2001，8（3）：305-316.

[19]Shanmuganathan S，Shanumugasundaram N，Adhirajan N，et al.Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery[J].Carbohydr Polym，2008， 73（2）：201-211.

[20]Shen F，Gaffen SL.Structure-function relationships in the IL-17 receptor：Implications for signal transduction and therapy[J].Cytokine，2008，41（2）：92-104.

[21]Dahiya S，Bhatnagar S，Hindi SM，et al.Elevated levels of active matrix metalloproteinase-9 cause hypertrophy in skeletal muscle of normal and dystrophin-deficient mdx mice[J].Hum Mol Genet，2011，20（22）：4345-4359.

[22]Camardo A，Seshadri D，Broekelmann T，et al.Multifunctional，JNK-inhibiting nanotherapeutics for augmented elastic matrix regenerative repair in aortic aneurysms[J].Drug Deliv Transl Res，2018，8（4）：964-984.

[23]Obradovic H，Krstic J，Kukolj T，et al.Doxycycline inhibits IL-17-stimulated MMP-9 expression by downregulating ERK1/2 activation：implications in myogenic differentiation[J].Mediat Inflamm，2016，2016：2 939 658.

[24]Pereira JA，Matsumura CY，Minatel E，et al.Understanding the beneficial effects of doxycycline on the dystrophic phenotype of the mdx mouse[J].Muscle Nerve，2014，50（2）：283-286.

[25]張海飛，趙廣，張治宇.多西環(huán)素在纖維連接蛋白誘導(dǎo)髓核細胞退變過程中的作用[J].中國組織工程研究，2018，22（20）：3123-3129.

[26]Prins HJ，Daniels JM，Lindeman JH，et al.Effects of doxycycline on local and systemic inflammation in stable COPD patients，a randomized clinical trial[J].Respir Med，2016，110：46-52.

[27]Zhang Z，Kolls JK，Oliver P，et al.Activation of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme-mediated ecto-domain shedding by nitric oxide[J].J Biol Chem，2000，275（21）：15 839-15 844.

[28]O′Sullivan S，Medina C，Ledwidge M，et al.Nitric oxide-matrix metaloproteinase-9 interactions：Biological and pharmacological significance NO and MMP-9 interactions[J].Biochim Biophys Acta，2014，1843（3）：603-617.

[29]Nascimento RA，Possomato-Vieira JS，Goncalves-Rizzi VH，et al.Hypertension，augmented activity of matrix metalloproteinases-2 and-9 and angiogenic imbalance in hypertensive pregnancy are attenuated by doxycycline[J].Eur J Pharmacol，2018，840：60-69.

[30]Pasternak B，Aspenberg P.Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics[J].Acta Orthop，2009，80（6）：693-703.

[31]Nakagawa T，Kakizoe Y，Iwata Y，et al.Doxycycline attenuates cisplatin-induced acute kidney injury through pleio-tropic effects[J].Am J Physiol Renal Physiol，2018，315（5）：F1347-F1357.

（收稿日期：2019-04-26? 本文編輯：任秀蘭）