一種金黃色葡萄球菌快速MPN檢測法及其方法比對研究

金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌之一，由其引發(fā)的食物中毒事件屢見不鮮，國家食品安全標準《GB 29921-2013》將其列為食品中最常見的五種致病菌之一，并要求使用平板計數(shù)法（涂布法）進行檢測。然而實際工作中往往會遇到一種情況，當樣品中目標菌濃度很低而背景菌濃度很高，低稀釋倍數(shù)下其目標菌會被大量的背景菌覆蓋，導致后續(xù)無法挑取目標菌菌落，而若提高稀釋倍數(shù)，則無法培養(yǎng)出目標菌落。此時，MPN計數(shù)法更能夠準確地反映出此類樣品中金黃色葡萄球菌的污染程度，因為MPN體系擁有高數(shù)量的平行管、小于十倍的稀釋倍數(shù)、更適宜的生長條件以及便于解釋和彌補的重復誤差。不過，國標中的MPN計數(shù)法也有其不足之處。第一，劃線分離和挑取可疑菌落的工作量大，劃線分離一個樣品就需要劃9塊BP平板，倘若有可疑菌落，每塊BP平板又需要挑5個可疑菌落做確認實驗，等于一個樣品最多要做45個兔血漿凝固酶實驗。第二，僅僅9管的MPN法，其準確性受到限制。MPN法的準確性取決于做的管數(shù)，管數(shù)越多，準確性就越高，但增加管數(shù)也就意味著更多的工作量、更高的檢測成本，這可能就是“限量標準”中不使用MPN法的原因之一。

本文介紹了一種快速的金黃色葡萄球菌MPN檢測法（以下簡稱“快速MPN檢測法”），可以大幅縮短檢測周期，節(jié)約企業(yè)檢測成本，還可以提高檢測準確性。

一、材料

7.5%Nacl肉湯，廣東環(huán)凱;1%亞碲酸鉀溶液，青島海博;兔血漿（RPFA）纖維蛋白原瓊脂，Bioker;Baird-Parker（BP）瓊脂，廣東環(huán)凱;凍干兔血漿，廣東環(huán)凱;腦心浸出（BHI）液肉湯，青島海博;96方孔板，2.2ml;金黃色葡萄球菌菌種，CICC 21600。

二、方法

1.快速MPN檢測法操作步驟。（1）檢樣制備。取25g（ml）樣品，放入盛有225ml7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯（每1000ml7.5%氯化鈉肉湯中加入1ml1%亞碲酸鉀溶液）的均質(zhì)袋內(nèi)，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min，混合均勻，制成1︰10的樣品均液。在7.5%氯化鈉肉湯中加入亞碲酸鉀的目的有兩個，一是亞碲酸鉀可以抑制非葡萄球菌的細菌生長，增加增菌時的選擇性;二是金黃色葡萄球菌能夠還原亞碲酸鉀產(chǎn)生黑色沉淀，方便結(jié)果觀察。（2）稀釋。取1︰10的樣品均液1.0ml，加入7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯9.0ml，渦旋混合均勻，制成1︰100的樣品均液。按此方法制備十倍系列稀釋樣品勻液。（3）加樣。選擇3個適宜稀釋度，每個稀釋度在96方孔板中接種3孔。接種的孔數(shù)和稀釋度可以增加，此處接種3孔和3個稀釋度是為了與國標法做比對。（4）培養(yǎng)。將接種后的96方孔板放入36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24h。（5）接種。反復振蕩96方孔板，然后用接種針蘸取底部變黑或疑似底部變黑的孔中培養(yǎng)物，穿刺接種于RPFA平板，每孔至少穿刺5次。將穿刺后的RPFA平板放入36±1℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6-24h。金黃色葡萄球菌能夠使RPFA中的兔血漿凝固，從而使菌落周圍出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)。（6）結(jié)果判斷。接種的RPFA平板上出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)的孔標記為金黃色葡萄球菌陽性孔。按金黃色葡萄球菌陽性孔數(shù)，檢索MPN表或使用MPN計算軟件，得到每g（ml）樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)。

2.國標MPN檢測法操作步驟。按照《GB 4789.10-2016/第三法金黃色葡萄球菌MPN計數(shù)法》進行。

3.分析方法。（1）相對精度（relative trueness）分析。選擇4種常見的檢測金黃色葡萄球菌的食品樣品，用金黃色葡萄球菌標準菌株分別進行人工污染，分別按照國標MPN檢測法和快速MPN檢測法進行檢測。每種樣品檢測5次，用所有4種樣品的5次平行數(shù)據(jù)繪制散點圖，其中不同種的樣品用不同的形狀表示，并畫出兩種方法對每個被分析樣本得出相同結(jié)果時的直線，這樣可以快速直觀地評估這兩種方法不一致的程度。計算每對數(shù)據(jù)的平均值和每對數(shù)據(jù)值之間的差異，并按樣品種類對所有參數(shù)繪制Bland-Altman一致性分析圖，從而直觀地說明數(shù)據(jù)的偏倚程度和一致性程度。（2）精度曲線（accuracy profile）分析。精度曲線用于檢查快速MPN檢測法與國標MPN檢測法產(chǎn)生的結(jié)果相差是否小于某個可接受標準值，這個可接受標準值在本文中設置為±0.5log10單位，也可以通過方法使用者與最終用戶之間達成的共識來決定。用6份含低中高濃度的人工污染樣品（全脂奶粉）檢測數(shù)據(jù)繪制精度曲線，以此比對兩種檢測方法在乳制品檢測中的一致程度。（3）凝固酶實驗靈敏度初探。快速MPN檢測法用穿刺接種RPFA替代傳統(tǒng)轉(zhuǎn)接兔血漿來確定菌株是否含有凝固酶，考慮到穿刺法接種的接種量遠不及傳統(tǒng)法的接種量，為驗證穿刺接種的有效性，需對其做靈敏度驗證。將金黃色葡萄球菌接種至BHI肉湯，在36℃條件下培養(yǎng)24h后，使用GB 4789.2-2016對其計數(shù)。分別用100、101、102、103、104級稀釋液穿刺RPFA，同時接種7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯，在36℃條件下接種24h后再次穿刺接種RPFA。

三、結(jié)果與分析

1.相對精度分析結(jié)果。根據(jù)四種樣品經(jīng)人工污染后通過兩種方法檢測的結(jié)果（結(jié)果取對數(shù)），全脂奶粉的平均差值為0.39，差值標準偏差為0.27;速凍水餃的平均差值為0.40，差值標準偏差為0.21;豬肉香腸的平均差值為0.22，差值標準偏差為0.10;三文魚片的平均差值為0.27，差值標準偏差為0.15。具體數(shù)據(jù)詳見表1，再將其繪制成散點圖和Bland-Altman一致性分析圖，詳見圖1和圖2。由散點圖（圖1）可見，無明顯偏離等差線（y=x）的結(jié)果點出現(xiàn)，說明兩種方法得出的檢測結(jié)果沒有出現(xiàn)極端的差異;由Bland-Altman一致性分析圖（圖2）可見，僅有一個結(jié)果差異點出現(xiàn)在95%下限之下，說明兩種方法得出的檢測結(jié)果的差異具有很大程度上的一致性。

2.精度曲線分析結(jié)果。6份中低高不同染菌量的全脂奶粉，用兩種檢測方法同時檢測5個平行后，得到的檢測結(jié)果見表2。將其繪制成精度曲線圖，見圖3。由精度曲線圖（圖3）可見，兩種方法得出的檢測結(jié)果的差異均在所設的可接受極限（AL）內(nèi)，說明兩種方法產(chǎn)生的結(jié)果差異性可接受。

3.凝固酶試驗靈敏度初探分析結(jié)果。（1）當菌液含菌量少于104CFU/mL時，直接穿刺RPFA后有部分接種點無菌落生長。當菌液含菌量在104CFU/mL以上時，所有接種點均有菌落生長，并且全部能夠產(chǎn)生凝固酶反應。也就是說，只要7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯管中的金黃色葡萄球菌能夠達到104CFU/mL，快速MPN檢測法即可檢測出陽性結(jié)果。（2）將100、101、102、103、104級稀釋液接種7.5%氯化鈉-亞碲酸鉀肉湯，在36℃條件下接種24h后穿刺RPFA，所有接種點均發(fā)生凝固酶反應。也就是說，當樣品中的金黃色葡萄球菌含量低至個位數(shù)時，經(jīng)快速MPN檢測法增菌后依然可以檢出陽性結(jié)果。

四、結(jié)論與討論

本文介紹了一種食品中金黃色葡萄球菌快速MPN檢測法，其優(yōu)點是檢測周期短，相比國標法可以縮短24小時，并且操作步驟簡單，省去了劃線分離等步驟。在與國標金黃色葡萄球菌MPN法的方法比對研究中，通過相對精度分析和精度曲線分析可以非常直觀地看出，兩種方法對常見的幾種食品中金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果具有高度一致性。由于本方法操作簡單，非常適合增加檢測管數(shù)，檢測管數(shù)越多，結(jié)果準確性就越高，值得推廣使用。

本文中凝固酶試驗靈敏度分析雖然是對本方法中凝固酶試驗靈敏度的初步研究，但卻證明了該方法的可行性，由于作者個人精力有限，未能在整體方法的靈敏性、特異性、包含性、排斥性等方面一一展開論述，歡迎對此感興趣的人士一起參與研究，一起為祖國的檢測行業(yè)貢獻一份力量。

作者簡介：凌超（1989-），男，上海，本科，工程師，研究方向：食品檢測。