黃鈺婷， 孫 潔， 張慧娟， 朱 晏， 蔣 明

(臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000)

蜘蛛抱蛋(Aspidistraelatior)又名一葉蘭、土蜈蚣、苞米蘭和箬葉等，為百合科(Liliaceae)鈴蘭族(Convallarieae)蜘蛛抱蛋屬多年生常綠宿根草本[1]。蜘蛛抱蛋葉片碩大、姿態(tài)優(yōu)美、花形奇特，具有較好的觀賞價值，常用于盆栽和公園地植[2]；蜘蛛抱蛋在光照不良的環(huán)境中有較好的固碳釋氧和增濕降溫能力，且其自然揮發(fā)物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和黑曲霉菌(Aspergillusniger)等有顯著的抑制作用，該植物在室內(nèi)美化方面具獨特的優(yōu)勢[3]。蜘蛛抱蛋的根莖可藥用，提取物中富含抗氧化劑和抗菌成分，具有活血化瘀、清熱解毒、抗菌消炎等功效[4-5]。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜘蛛抱蛋炭疽病的發(fā)生十分嚴重，發(fā)病時葉面產(chǎn)生褐色病斑，后逐漸擴大蔓延至整張葉片，影響植株的生長和發(fā)育，也影響觀賞價值。

植物炭疽病是世界性病害之一，危害多種野生植物和栽培植物，該病主要由炭疽菌屬(Colletotrichum)真菌引起，可侵染植物的所有部位，尤其是地上部分[6-8]。近年來，有關(guān)蜘蛛抱蛋的研究主要集中在栽培管理、藥理作用和化學(xué)成分等方面[2，5，9]，而與炭疽病相關(guān)的研究未見報道。本研究以蜘蛛抱蛋炭疽病病葉為材料，在病原菌的分離、純化、致病性測定、形態(tài)學(xué)特征觀察的基礎(chǔ)上，克隆核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosomal DNA internal transcribed spacer，ITS)、肌動蛋白基因(actin，ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin，CAL)，進行多基因聯(lián)合鑒定，以明確炭疽病病原真菌的種類，為后續(xù)開展病害有效防治和致病機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集、病原菌的分離與純化

蜘蛛抱蛋病葉采自不同的公園和中學(xué)校園，共采集到6份樣品，帶回實驗室后置于4 ℃冰箱備用。采用組織分離法分離病原菌，將蜘蛛抱蛋病葉洗凈后切成小塊，依次用蒸餾水漂洗8 min、1%次氯酸鈉漂洗8 min、無菌水清洗2次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上。28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后挑取新鮮菌絲，接種于新的PDA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

純化后的菌絲置于Soptop倒置生物顯微鏡ICX 41下，觀察形態(tài)、分生孢子的形狀和大小。蜘蛛抱蛋病葉與純化后的菌絲經(jīng)干燥處理，用導(dǎo)電膠將菌絲和病葉粘在樣品托上，用日立E-1010型離子濺射儀噴金處理，然后置于日立S-4800型掃描電鏡中，觀察病原菌菌絲形態(tài)、孢子特征，以及病葉上菌絲的分布情況。

1.3 致病性測定

采用回接法研究致病性，選取健康的蜘蛛抱蛋葉片，用大量的無菌水清洗，自然晾干后用無菌剪刀剪成大小相同的離體小塊；利用無菌接種針刺傷表皮，用無菌打孔器(直徑5 mm)切取菌餅，菌絲面朝下，接種于刺傷部位，重復(fù)3次，空白對照為無菌PDA圓塊，接種后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。

1.4 病原菌的分子鑒定

1.4.1 基因組DNA的提取

收集培養(yǎng)皿中蜘蛛抱蛋炭疽病病原菌的菌絲，經(jīng)液氮冷凍后，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA，經(jīng)電泳檢測和濃度測定后，將DNA溶液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因片段的克隆

以DNA為模板，采用表1的通用引物[10-11]，對ITS、ACT、GAPDH、CAL序列進行PCR條件優(yōu)化，并獲得最適退火溫度(表1)。PCR采用20 μL反應(yīng)體系：16.1 μL ddH2O，2.0 μL 10×buffer，0.5 μL dNTPs(20 mmol·L-1)，0.2 μL上、下游引物(20 μmol·L-1)，0.5 μL DNA模板(40 ng·μL-1)和0.5 μLTaqDNA聚合酶。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56.3℃或62.1℃退火45 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 PCR引物和最佳退火溫度Table 1 PCR Primers and their optimum annealing temperatures

1.4.3 基因片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測后，采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的DNA快速回收試劑盒回收各引物對擴增的PCR產(chǎn)物。取3 μL回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體置于4 ℃冰箱連接過夜，采用熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細胞；涂布培養(yǎng)后，挑選白色單菌落振蕩培養(yǎng)12 h，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切、菌液PCR檢測后，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行同源性搜索并下載序列，利用ClustalX軟件進行多重比對，采用默認參數(shù)；通過GeneDoc軟件生成比對圖；用MEGA 3.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法采用鄰接法(neighbour-joining)，自舉檢測(bootstrap)1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

在自然條件下，蜘蛛抱蛋葉片患病初期病斑褐色，后逐漸擴大蔓延，形狀不規(guī)則，病斑中部逐漸發(fā)白，但四周仍為褐色，病健交界處可見淡黃色暈圈，最后病斑處出現(xiàn)穿孔，發(fā)病嚴重時導(dǎo)致整個葉片干枯死亡(圖1-A、圖1-B)。在掃描電子顯微鏡下，可觀察到菌絲通過葉片氣孔侵入葉片內(nèi)部(圖1-C)。

A，患病植株；B，病斑特寫；C，菌絲通過氣孔侵入葉片內(nèi)部，2 500×。A， Infected plants; B， Leaf lesion; C， Penetration by fungal hyphae through a stomatal pore， 2 500×.圖1 蜘蛛抱蛋炭疽病病葉特征Fig.1 Anthracnose symptoms on leaves of Aspidistra elatior

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

通過對蜘蛛抱蛋炭疽病病原菌的分離和純化，得到1個真菌菌株，命名為YYL。病原真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲呈放射狀，營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生色素使培養(yǎng)基中央顏色加深，氣生菌絲呈白色絨毛狀，菌絲生長速率平均為0.85 cm·d-1(圖2-A)。在倒置生物顯微鏡ICX 41和日立S-4800掃描電子顯微鏡下可觀察到細長菌絲，菌絲表面光滑、彎曲幅度較小，有隔膜；菌絲分支較多且常呈銳角；分生孢子梗頂端有較多分生孢子著生，大分生孢子呈新月形，中央有4～6個油球；小分生孢子近橢圓形，邊緣平滑，平均大小約為72 μm × 28 μm(圖2-B、圖2-C、圖2-D)。

A，菌落形態(tài)；B，菌絲形態(tài)；C，分生孢子形態(tài)；D，掃描電子顯微鏡下菌絲與孢子形態(tài)。A， Colonial morphology; B， Hypha morphology; C， Conidia morphology; D， Morphology of hypha and spores under a scanning electron microscope.圖2 病原菌YYL的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of pathogenic fungus YYL

2.3 致病性

病原菌回接實驗結(jié)果顯示，葉片接種后的發(fā)病率為100%。接種培養(yǎng)5 d，葉片傷口處出現(xiàn)直徑5～6 mm的褐色病斑，培養(yǎng)11 d時葉片變軟，中央部分呈褐色，其余部分變成黃褐色，發(fā)病情況與自然條件下一致；對照組葉片沒有觀察到病斑，葉色無顯著變化(圖3)。

A，對照；B，接種病原菌的葉片。A， Control; B， Leaf inoculated with pathogenic fungus.圖3 致病性檢測Fig.3 Pathogenicity detection

2.4 分子鑒定

2.4.1 基因片段的克隆

采用ITS、ACT、GAPDH、CAL的通用引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測均得到單一明亮的特異性條帶(圖4)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序，得到各自的DNA序列。結(jié)果表明，ITS、ACT、GAPDH和CAL序列長度分別為488、237、259、760 bp。

M， DL 2000 DNA標(biāo)準分子量；1～2，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；3～4，肌動蛋白基因；5～6，3-磷酸甘油醛脫氫酶基因；7～8，鈣調(diào)蛋白基因。M， DL 2000 DNA marker; 1-2， ITS; 3-4， ACT; 5-6， GAPDH; 7-8， CAL。圖4 不同基因片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products about different gene fragments

2.4.2 序列多重比對

將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST比對，結(jié)果顯示，病原菌ITS序列與百合炭疽菌(C.lilii)(GU227810)及其近緣種黑線刺盤孢(C.dematium)的序列相似性達100%；ACT序列與百合炭疽菌(GU227908)相似度達99.16%；ClustalX等軟件多重比對結(jié)果顯示，僅在第144、173個堿基位點發(fā)生顛換(圖5)；GAPDH序列與百合炭疽菌(GU228202)相似度達100%；NCBI沒有百合炭疽菌的CAL序列，但其近緣物種黑線刺盤孢(GQ849455)與蜘蛛抱蛋YYL的CAL序列相似性高達99.71%。

2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載ITS、ACT、GAPDH和CAL的同源序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。YYL-ITS及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中，10種病原菌可分為7支，其中，YYL、百合炭疽菌和黑線刺盤孢在同一分支，支持率為89%(圖6-A)；YYL-ACT及其同源序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為5支，YYL和百合炭疽菌聚于一支(圖6-B)；基于GAPDH構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，YYL也與百合炭疽菌聚為一組，支持率達92%(圖6-C)；YYL-CAL及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，10種病原菌可分為6組，YYL和黑線刺盤孢處于同一分支，親緣關(guān)系最近(圖6-D)。

A，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；B，肌動蛋白基因；C，3-磷酸甘油醛脫氫酶基因；D，鈣調(diào)蛋白基因。MH292787，Colletotrichum liriopes；MH292784，C. tofieldiae；KC843542，C. bletillum；MN752248，C. incanum；GU227908，百合炭疽菌；MN433299，白蠟樹刺盤孢；GQ856785，黑線刺盤孢；KC843538，貴州刺盤孢；JQ005837，C. cereale。A， ITS; B， ACT; C， GAPDH; D， CAL. MH292787， Colletotrichum liriopes; MH292784， C. tofieldiae; KC843542， C. bletillum; MN752248， C. incanum; GU227908， C. lilii; MN433299， C. spaethianum; GQ856785， C. dematium; KC843538， C. guizhouensis; JQ005837， C. cereale.圖6 基于基因片段及其同源序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on gene fragments and their homologous sequences

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬真菌分布廣泛，危害多種栽培植物，如西瓜(Citrulluslanatus)、火龍果(Hylocereusundulatus)、核桃(Juglansregia)和油茶(Camelliaoleifera)等[11-14]。菌落、菌絲、分生孢子梗、分生孢子等的形態(tài)特征可用于炭疽病病原菌的鑒定，連金番等[15]根據(jù)危害癥狀、菌落特征和病原菌形態(tài)特點，明確了大豆平頭炭疽菌(C.truncatum)為寧夏引黃灌區(qū)春大豆(Glycinemax)炭疽病的病原菌；炭疽菌的形態(tài)特征易隨培養(yǎng)條件改變，三角梅(Bougainvilleaglabra)和火龍果炭疽病的病原菌均為膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，兩者分離得到的菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落、氣生菌絲和分生孢子的形態(tài)、顏色均不相同，因此需要其他手段輔助鑒定[16-17]。真菌ITS區(qū)保守性較高，利用ITS序列生成的系統(tǒng)發(fā)育樹可以對大多數(shù)物種進行正確分組，但對部分物種的鑒定存在分辨率不高的現(xiàn)象[18]。炭疽菌屬真菌種類繁多，對它們進行正確識別有助于病害防治和機理研究，但單純使用ITS序列無法對所有物種進行正確鑒別[19]。本研究中，YYL-ITS與黑線刺盤孢和百合炭疽菌的相似性達100%，僅用ITS序列無法確定該菌株的歸屬。

形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因序列的方法被廣泛應(yīng)用于炭疽菌的分類識別，近年來有大量的炭疽病病原菌得以鑒定[20]。帥小春等[21]采用ITS、CAL、GAPDH、ACT和TUB基因片段結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將油茶炭疽病植株中分離的菌株鑒定為3種炭疽菌，它們是哈瓦炭疽菌(C.kahawae)、果生炭疽菌(C.fructicola)和山茶炭疽菌(C.camelliae)。樊改麗[22]利用顯微結(jié)構(gòu)、菌落特征和多基因比對，認為大葉棕竹(Rhapisexcelsa)炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢菌(C.siamense)。徐婧等[23]結(jié)合形態(tài)和多基因分子數(shù)據(jù)，確定引起高粱(Sorghumbicolor)炭疽病的致病菌為亞線孢炭疽菌(C.sublineolum)。本研究中，YYL的菌落、菌絲和分子孢子等符合百合炭疽菌特征，YYL的ITS、ACT和GAPDH與百合炭疽菌在發(fā)育樹上均聚于一組，雖然NCBI沒有百合炭疽菌CAL序列，但YYL-CAL與其近緣種黑線刺盤孢聚于一組。

本研究分離純化了蜘蛛抱蛋炭疽病病原菌，并開展了致病性、形態(tài)特征與多基因聯(lián)合鑒定，初步確定該病原菌為百合炭疽菌，為后續(xù)開展病害有效防治和致病機理研究奠定了基礎(chǔ)。