周先文，王曉清，王 佩，江 輝，曾 丹，彭英海

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；2.湘西州畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 吉首 416000)

中華鱉(Trionyxsinensis)是龜鱉目龜鱉科的代表動物，為中國的特色養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量位居世界第一，近年來我國學(xué)者對中華鱉的生長[1]、營養(yǎng)[2-4]、病害[5-6]和育種[7]等方面開展了大量的研究。中華鱉雄性生長普遍快于雌性，其雄性裙邊厚，市場價格高于雌性，實(shí)行中華鱉雄性單性養(yǎng)殖能獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益[8]。根據(jù)水產(chǎn)動物的特性有針對性地進(jìn)行育種研究，有利于提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在水產(chǎn)動物的性別研究中，硬骨魚類的性成熟受腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，下丘腦通過分泌激素到垂體促性腺細(xì)胞上，促進(jìn)卵泡激素等的合成與釋放，對性腺發(fā)育和配子形成等產(chǎn)生作用[9-10]。近來的研究表明，Dmrt1和Amh是中華鱉雄性的重要調(diào)控因子[8，11]，Cyp19a1和Foxl2為中華鱉卵巢的調(diào)節(jié)因子。然而，中華鱉的性別決定機(jī)制尚未闡明，中華鱉在自然生產(chǎn)過程中3齡達(dá)到性成熟，此階段為性別相關(guān)基因高度表達(dá)階段。通過差異表達(dá)基因的研究，可進(jìn)一步驗(yàn)證中華鱉性別差異候選基因，探索其對性別決定的影響，對明晰中華鱉的性別決定機(jī)制有著十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年9月25日從常德市鼎城區(qū)河州龜鱉養(yǎng)殖專業(yè)合作社購買3齡中華鱉雌雄各6只，體重994.05～1 286.48 g。分別取中華鱉雌性的卵巢和雄性的精巢，每個個體取2份性腺組織樣品放置于凍存管中，液氮速凍后置-80℃冰箱保存。

1.2 RNA提取及cDNA制備

解剖獲得中華鱉精巢和卵巢組織，每個樣品取2份，其中一份用于轉(zhuǎn)錄組分析，另一份進(jìn)行RNA提取用于熒光定量PCR驗(yàn)證試驗(yàn)，RNA提取采用RNA提取試劑盒(OMGA，廣州)，購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。cDNA制備采用賽默飛的cDNA試劑盒，按試劑盒說明合成cDNA。

1.3 文庫構(gòu)建及測序

文庫構(gòu)建及測序委托武漢菲沙基因信息有限公司完成，樣品檢測合格后，通過試劑盒去除rRNA富集mRNA。加入fragementation buffer將mRNA打斷，以mRNA為模板，用隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入dNTPs等合成cDNA，再用AMpure XP beads進(jìn)行片段大小選擇、擴(kuò)增及純化PCR產(chǎn)物，最后獲得文庫；對文庫采取Qubit 2.0初步定量，然后用Agilent 2100對插入片段長度進(jìn)行檢測。庫建合格后，利用Illumina Hiseq X平臺進(jìn)行HiSeq雙端測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)下機(jī)得到raw data，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，去接頭信息，低質(zhì)量堿基等得到clean data，將clean data與中華鱉參考基因組比對，進(jìn)行基因注釋，注釋后的基因作表達(dá)分析、樣品相關(guān)性分析、差異表達(dá)分析、GO富集、KEGG富集、轉(zhuǎn)錄因子分析、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析等。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對利用TopHat 2[12]，調(diào)用Bowtie 2[13]將每個樣本質(zhì)控后的二代序列比對到中華鱉的參考基因組序列，中華鱉的參考基因組下載地址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/14578?genome_assembly_id=44853。

表達(dá)水平分析利用RSEM[14]，調(diào)用Bowtie 2進(jìn)行比對，將樣品比對到每個轉(zhuǎn)錄本上的Reads數(shù)目，進(jìn)行FPKM(Fragments per kilobase per Million bases)轉(zhuǎn)換，最后，獲得基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。基因差異表達(dá)分析的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的expected_count數(shù)據(jù)，用R語言包DEseq 2[15]進(jìn)行差異分析，采用FDR(False discovery rate)和log2FC(Fold change)進(jìn)行篩選，其中上調(diào)表達(dá)的，滿足條件FDR<0.05、log2FC>1；下調(diào)的差異表達(dá)的基因數(shù)目，滿足條件FDR<0.05、log2FC<-1。差異表達(dá)基因的Gene Ontology[16](簡稱GO，http：//www.geneontology.org/)是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。分析獲得的差異基因在Gene Ontology中的分布狀況及其在中華鱉性腺發(fā)育中的作用，GO采用超幾何分析，選取FDR≤0.05的GO term作為顯著富集的GO條目。同時對差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG分析，差異表達(dá)基因的KEGG[17-18](Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關(guān)Pathway的公共數(shù)據(jù)庫，Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，以獲得差異基因相對于所有注釋基因顯著富集的通路。為分析差異基因蛋白互作情況，研究通過STRING蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org/)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對差異表達(dá)蛋白以Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化編輯。

1.5 RT-qPCR驗(yàn)證

選取12個差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，用Primer 6.0設(shè)計引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用TB GreenTMPre mix EXTapTM熒光定量表達(dá)試劑盒，采用2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)置3表重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)結(jié)果與分析

對3齡中華鱉精巢和卵巢分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到精巢和卵巢clean data各為21 494 396 400 bp和24 605 142 600 bp。通常以過濾后得到的clean data的百分比來說明數(shù)據(jù)的可靠性和精確性；以Q30作為堿基質(zhì)量檢測的標(biāo)準(zhǔn)，Q30>85%則表示可以進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。3齡中華鱉精巢組織Q30≥92.7%，3齡中華鱉卵巢組織Q30≥90.3%(表1)。

表1 使用Illumina Hiseq X平臺測序過濾后的數(shù)據(jù)結(jié)果

2.2 測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果

Mapping rate是指映射clean reads的比率，是轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)使用率最直接的表示(表2)。在此次的比對結(jié)果中，3齡中華鱉精巢和卵巢組織的Reads與參考基因組的比對效率在53.7%～67.5%之間。通過分析比對效率的結(jié)果，可以確定所選的中華鱉參考基因組的組裝滿足信息分析需求。

表2 Reads與參考基因組的比對情況

2.3 差異基因的表達(dá)水平分析

通過比較分析3齡中華鱉精巢和卵巢組織的差異表達(dá)基因，總的差異基因10 145個，其中在雌性卵巢中表達(dá)上調(diào)4 034個、表達(dá)下調(diào)6 111個。為直觀顯示兩組樣本間FDR和差異倍數(shù)FC的分布情況，繪制了MA plot和volcano plot(圖1)。

2.4 差異基因的GO分類及富集分析

以生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能為主要內(nèi)容的GO數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)分類與功能注釋，總共有10 145個差異基因注釋到10 291個GO分支中，每個類別列出10個以上注釋最多的子類別。

在GO-生物學(xué)過程中注釋到細(xì)胞過程(Cellular process)、單一生物過程(Single-organism process)、代謝過程(Metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)、生物過程調(diào)節(jié)(Regulation of biological process)的基因個數(shù)依次是1 999、1 701、1 486、1 424和1 358個；在GO-細(xì)胞組分?jǐn)?shù)據(jù)庫中，注釋到細(xì)胞(Cell)和細(xì)胞組分(Cell part)的均為1 945個，注釋到細(xì)胞器(Organelle)為 1 593個，注釋到細(xì)胞膜(Membrane)的有1 206個；在GO-分子功能數(shù)據(jù)庫中，1 722個基因注釋到連接(Binding)，951個基因注釋到催化活性(Catalytic activity)，以上通路在各類別中注釋的基因較多(圖2)。

為進(jìn)一步分析中華鱉雌雄性別差異方面的功能，對生殖過程，配子產(chǎn)生、性腺分化等通路進(jìn)行分析，其中注釋到生殖過程(Reproductive process)的有105個；注釋到單一有機(jī)體生殖過程(Single organism reproductive process)的有97個；注釋到多有機(jī)體生殖過程(Multi-organism reproductive process)76個；注釋到有性生殖(Sexual reproduction)的有71個；注釋到胚胎發(fā)育結(jié)束于出生與卵孵化(Embryo development ending in birth or egg hatching)的有69個；注釋到多細(xì)胞生物的生殖過程(Multicellular organismal reproductive process)的有64個；注釋到配子產(chǎn)生(Gamete generation)的有56個；注釋到性別分化(Sex differentiation)的有21個；注釋到性腺發(fā)育(Gonad development)的有18個等。將上述通路篩選到差異基因進(jìn)行匯總，得到122個精巢和卵巢差異表達(dá)的基因(表3)。

表3 中華鱉性別差異表達(dá)基因GO注釋結(jié)果

2.5 差異表達(dá)基因KEGG注釋及富集分析

為鑒別差異基因在中華鱉性腺中的具體功能，通過KEGG數(shù)據(jù)庫對富集的信號通路進(jìn)行分析，在中華鱉雌雄差異基因表達(dá)研究時發(fā)現(xiàn)，富集通路最多的是代謝和有機(jī)體系的通路；而在KEGG富集基因通路中，富集基因數(shù)目上依次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、免疫系統(tǒng)(Immune system)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)、細(xì)胞過程中分類運(yùn)輸和分解代謝(Transport and catabolism)、真核細(xì)胞社區(qū)(Cellular community-eukaryotes)，富集的基因分別為641、317、296、305、244(圖3)。這為之后中華鱉性別差異研究和性別決定基因篩選提供了參考。

此外，實(shí)驗(yàn)通過富集最顯著的20條通路，繪制了差異表達(dá)基因的KEGG富集散點(diǎn)圖(圖4)，可以對差異表達(dá)基因的途徑進(jìn)行整體分析。圖中Rich factor指通路中的富集程度，Q-value是校正之后的P-value，數(shù)值越小表示富集越顯著。在3齡中華鱉精巢與卵巢轉(zhuǎn)錄組差異的研究中，綜合分析通路富集程度大及富集顯著的主要有多能干細(xì)胞調(diào)節(jié)信號通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)、催產(chǎn)素信號通路(Oxytocin signaling pathway)、精氨酸生物合成信號通路(Arginine biosynthesis)、磷酸鹽和磷酸鹽代謝(Phosphonate and phosphinate metabolism)、磷脂肌醇信號通路(Phosphatidy-linositol signaling system)和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等。這些富集了不同差異表達(dá)基因的通路，影響中華鱉機(jī)體的個體機(jī)能，其中催產(chǎn)素信號通路(Oxytocin signaling pathway)和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等通路含有部分性別相關(guān)基因，對中華鱉性別維持等方面具有重要的作用。

為進(jìn)一步鑒定差異基因在精巢和卵巢中的功能。本研究將10 145個差異基因注釋到283個信號通路進(jìn)行分析。差異基因注釋比例最多的信號通路是PI3K-Akt信號通路(上調(diào)85個、下調(diào)48個)，其次一些包括性別相關(guān)的信號通路如：Wnt信號通路(上調(diào)37個、下調(diào)14個)，催產(chǎn)素信號通路(上調(diào)31個、下調(diào)32個)，F(xiàn)oxo信號通路(上調(diào)34個、下調(diào)13個)，卵巢類固醇生成素信號通路(上調(diào)14個、下調(diào)15個)等差異基因也較多。

2.6 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將差異蛋白結(jié)果數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到Cytoscape軟件進(jìn)行可視化編輯，構(gòu)建了成熟期中華鱉精巢和卵巢組織差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及其子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Foxl2與中華鱉性別決定相關(guān)，該蛋白的子網(wǎng)絡(luò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)較為繁簡適中(圖5)；而在雄性蛋白互作子網(wǎng)絡(luò)中，SMC通路在雄性相關(guān)蛋白的子網(wǎng)絡(luò)中起著調(diào)控作用(圖6)。

注：紅色代表在卵巢中上調(diào)，藍(lán)色代表在卵巢中下調(diào)，顏色越深表示上調(diào)/下調(diào)越明顯；PO(positive)：代表兩個蛋白呈正相關(guān)；NE(negative)：兩個蛋白之間呈負(fù)相關(guān)。

2.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取了12個基因(引物見表4)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)RT-qPCR得到的數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致(圖7)，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

表4 熒光定量PCR引物列表

3 討論

3.1 中華鱉雌性差異表達(dá)基因

本研究結(jié)果顯示，中華鱉雄性和雌性各3個轉(zhuǎn)錄組的clean data分別為7 546 271 100、6 996 473 400、6 951 651 900 bp和10 234 669 800、7 293 149 700、7 077 323 100 bp。以Q30作為堿基測量的標(biāo)準(zhǔn)，Q30均大于91.6%，在隨機(jī)打斷的cDNA片段測得的GC含量大于51.4%。將3齡中華鱉精巢和卵巢的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，共得到10 145個差異基因，其中在卵巢中4 034個基因上調(diào)、6 111個基因下調(diào)?；趯?shù)據(jù)庫中的比對信息，對性別相關(guān)的GO富集前26個主要富集通路基因進(jìn)行初步篩選，獲得117個性別表達(dá)差異的基因，結(jié)合KEGG富集及蛋白互作發(fā)現(xiàn)，對中華鱉性別決定有影響的性別相關(guān)基因，如在卵巢中高表達(dá)的Foxl2、Sox3、Sox7、Bmp4、Csf1、Wnk2、Mtmr4、Gsc、Nr2f2、Fgf9、Tgfβ2、Tgfβ3、Rara、Smd2、Wdr1、Smd3和Smad5等。

Foxl2是一個重要的雌性偏好基因，在模式生物斑馬魚中，F(xiàn)oxl2a和Foxl2b作用于雌性卵巢的分化和維持，F(xiàn)oxl2b還有抑制卵巢分化的作用[19]。Foxl2在虹鱒卵巢中也特異性表達(dá)[20]。Foxl2在泰國斗魚雌性性腺中的表達(dá)量要高于雄性，組織表達(dá)具有顯著的特異性和性差異，對泰國斗魚卵巢發(fā)育和性別調(diào)控有重要的作用[21]。高麗麗等對Foxl2基因的研究中，雌性中華鱉Foxl2基因?qū)π约に氐膽?yīng)答基本相同，但在雄性中Foxl2的應(yīng)答則不同[22]。此外，F(xiàn)oxl2基因在香港牡蠣性腺中的表達(dá)量也要高于其他組織[23]。成纖維生長因子9(Fgf9)是性腺發(fā)育的重要信號因子，敲低Fgf9抑制山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞的T分泌[24]；Fgf9敲除的小鼠還會發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重時出現(xiàn)死亡[25]。Bmp4是生殖細(xì)胞發(fā)生分化和形成配子的重要信號因子[26]，Bmp4與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，將信號傳入細(xì)胞核調(diào)節(jié)原始生殖細(xì)胞的生成[27]。Smd2和Smad3是調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育的重要因子[28]。Yao B等研究發(fā)現(xiàn)，在斜帶石斑魚中Sox3基因持續(xù)表達(dá)誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞向卵原與卵母細(xì)胞發(fā)育，若停止表達(dá)則反之向精原細(xì)胞發(fā)育[29]。敲除Sox3基因后的小鼠出生后的生長繁殖受到影響[30]。Sox3基因在金線魚性腺中的表達(dá)量最高，存在組織表達(dá)和性別表達(dá)差異[31]。Sox7是爪蟾生殖細(xì)胞發(fā)育所必須的轉(zhuǎn)錄因子，對爪蟾生殖質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)錄激活、生殖細(xì)胞維持有重要的作用[32]。肌維管束蛋白14(Mtmr14)在睪丸、大腦等組織廣泛表達(dá)[33]；過表達(dá)Mtmr4會減弱早期核體內(nèi)Smad3的活性，從而影響其核定位[34]。在本實(shí)驗(yàn)蛋白與蛋白相互作用中Bmp4、Mtmr4均與Smad2、Smad3存在正相關(guān)作用，而Smad2、Smad3與Foxl2存在正相關(guān)作用，由此表明，在中華鱉中Bmp4與Mtmr4可能通過作用于Smad2和Smad3來影響Foxl2的表達(dá)。

此外，Diakite Haidou研究發(fā)現(xiàn)，Nr2f2在尼羅羅非魚中有Nr2f2a和Nr2f2b兩個基因，Nr2f2a和Nr2f2b在卵原細(xì)胞和初級卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，Nr2f2a在體細(xì)胞和雄性生殖細(xì)胞中均有表達(dá)，但是在尼羅羅非魚雄魚精巢中沒有檢測到Nr2f2b的表達(dá)[35]。此外，下調(diào)Sara的表達(dá)水平或者阻斷Tgfβ信號將改善Wdr81不足引起的海馬神經(jīng)發(fā)生障礙[36]，即Wdr81可能對Tgfβ相關(guān)基因的表達(dá)會產(chǎn)生一定的影響。吳燕華研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠卵巢中的Id4基因后，小鼠仍然具備繁殖能力，在哺乳動物卵巢發(fā)育中，敲除Id4促進(jìn)增殖的作用可能是通過其他轉(zhuǎn)錄因子來補(bǔ)償?shù)腫37]。在中華鱉性別表達(dá)基因，Wdr1和Nr2f2在卵巢中的表達(dá)量顯著高于雄性，可能與卵巢的發(fā)育有關(guān)。

3.2 中華鱉雄性差異表達(dá)基因

本研究中華鱉雄性中表達(dá)量較高的基因有Dmrt1、Amh、Sox30、Cct4、Cct5、Cldn11、Crem、Smc4、Top2a、Hook1、Spag6、Spata16、Spata24、Hormad1、Dhcr24、Dnai2、Dynll1、Gabarap、Herc4、Herpud2、Hexb、Hpgds、Ica1l、Meioc、Mlh1、Nme5、Nphp1、Pacrg、Ran、Rnf17、Rnf212b、Ropn1l、Saxo1、Spa17、Spire1、Stra13、Syce3、Tekt2、Tekt3、Ttc5和Zmynd15等。

Dmrt1基因是最古老的性別相關(guān)基因，在精巢的分化中起著重要的作用[38]。黃洋等的研究發(fā)現(xiàn)Dmrt1基因在泰國斗魚雄性的性腺和脾臟中特異性表達(dá)，在雌性性腺和肝臟中不表達(dá)，可能只參與泰國斗魚雄性的生殖發(fā)育[39]。在黃喉擬水龜中Dmrt1在精巢中的表達(dá)高于卵巢，可能參與黃喉擬水龜?shù)男詣e決定過程[40]。孫偉等的研究發(fā)現(xiàn)，Dmrt1基因過表達(dá)后，會引起ZW型胚胎向雄性分化，在中華鱉雄性性別分化的過程中發(fā)揮著重要的作用[41]。本研究對3齡中華鱉的研究結(jié)果顯示，Dmrt1、Dmrta2和Dmrtb1在精巢中表達(dá)顯著高于卵巢，表明Dmrt1、Dmrta2和Dmrtb1為中華鱉雄性偏好基因。谷偉等研究發(fā)現(xiàn)，激素誘導(dǎo)使偽雄虹鱒魚腦和性腺中的抗穆勒氏管激素Amh基因表達(dá)量顯著高于雌性虹鱒，在雄性性腺分化中發(fā)揮著重要的作用[42]。在斜帶石斑魚中，Amh-Smad-Cyp19ala有信號通路存在，Amh-Smad和Amh-Cyp19ala呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Amh激活Smad信號通路，而Smad和Cyp19a1a啟動子Smad結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，降低Cyp19ala的表達(dá)量，使得雌激素表達(dá)量下降，雄激素表達(dá)量上升[43]。Amh基因在黃顙魚中表達(dá)水平最高的是性腺，其次是腦和肝臟，1齡黃顙魚雄性性腺中的表達(dá)量最高，Amh基因可能作用于黃顙魚雄性性腺分化[44]。Amh基因是中華鱉早期性腺分化的關(guān)鍵因子，Amh在雄性中華鱉成體性腺中高水平表達(dá)，在胚胎期，使用芳香化酶抑制劑后Amh表達(dá)量上升，使用雌二醇誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)則Amh表達(dá)量下降[45]。本研究在3齡中華鱉中Amh基因在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢，因此，Amh為中華鱉雄性性別決定的關(guān)鍵因子[11]。Cldn11缺失會影響雄性小鼠的精子發(fā)育，而對雌性的生育能力無影響[45]。鉤狀同系物蛋白基因hook1與精子的連接有關(guān)，hook1基因缺失將對精子的連接產(chǎn)生影響[11]。Herc4基因?qū)拥漠a(chǎn)生和功能發(fā)揮起作用[46]。三倍體泥鰍Hormad1基因在雄性性腺中的表達(dá)量最高，雌性則在鰭中的表達(dá)量最高，可能調(diào)控其早期性腺分化[47]。Ptgds在公雞弱精癥的睪丸組織中的表達(dá)量顯著高于對照組[47]。Spag6基因被敲除的小鼠精子數(shù)量減少，精子結(jié)構(gòu)被破壞，Spag6在精子運(yùn)動及發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[48]。Sox30為睪丸特異轉(zhuǎn)錄因子，在出生后7 d小鼠的睪丸組織中就可以檢測到Sox30 mRNA[49]；Sox30基因缺失后，小鼠一部分精母細(xì)胞發(fā)生缺陷，而精子變形過程停止，同時缺失Sox30基因的小鼠表型與敲除Crem轉(zhuǎn)錄因子的小鼠表型基本一致[50]；Sox30在尼羅羅非魚性腺中特異性表達(dá)，在精巢的生殖細(xì)胞和卵巢的體細(xì)胞中表達(dá)[51]。唐耀浩對羅非魚Sox30基因的研究發(fā)現(xiàn)，Sox30在尼羅羅非魚精巢中表達(dá)，在90～180 d尼羅羅非魚的卵巢中不表達(dá)，Dmrt1敲低后，尼羅羅非魚精巢中Sox30的表達(dá)量降低，兩者可能存在正相關(guān)作用，Dmrt1過表達(dá)后Sox30的轉(zhuǎn)錄活性升高，Dmrt1與Sox30啟動子上的順式作用元件結(jié)合正向調(diào)控Sox30基因的轉(zhuǎn)錄[52]。此外，環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件調(diào)節(jié)物基因Crem基因的缺失會引起小鼠不育[53]。

在中華鱉雄性蛋白-蛋白互作子網(wǎng)絡(luò)中，Smc4、Msh4、Msh5和Actl6b正向調(diào)控Top2a和Top2b的表達(dá)，Atf1與Crem兩者正相關(guān)。雌性相關(guān)蛋白Wdr1通過Wdr1-Acta1-Smarcd1-Baz1b負(fù)反饋?zhàn)饔糜谛坌韵嚓P(guān)蛋白Top2a和Top2b的表達(dá)；同時雌性相關(guān)蛋白Wdr1還通過Wdr1-Acta1-XLOC_043302-Egr1和Atf1負(fù)反饋?zhàn)饔糜贑rem。Smc4、Top2a、Top2b和Crem在中華鱉精巢的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究通過GO、KEGG注釋及蛋白-蛋白互作，獲得了大量的差異基因的功能信息。在GO數(shù)據(jù)庫中對功能信息進(jìn)行注釋并分類，包括生殖過程、配子產(chǎn)生、性別分化、性腺發(fā)育等。這些差異基因功能注釋信息表明其可能在中華鱉的生殖、配子產(chǎn)生、性別分化和性腺發(fā)育等方面發(fā)揮作用，在中華鱉性別形成的二態(tài)性的形成過程中產(chǎn)生作用。3齡中華鱉為性別成熟期，進(jìn)入繁殖階段，該階段產(chǎn)生的性別差異較多，有利于從廣泛篩選性別相關(guān)基因方面，為后續(xù)中華鱉性別決定機(jī)制的研究提供重要的參考。

KEGG注釋結(jié)果同樣豐富了功能通路信息，如PI3K-Akt信號通路、Wnt信號通路、催產(chǎn)素信號通路、Foxo信號通路、卵巢類固醇生成素信號通路等。其中PI3K-Akt信號通路在雌性生殖細(xì)胞生長發(fā)育中產(chǎn)生作用[54]。此外，催產(chǎn)素信號通路和卵巢類固醇生成素信號通路等與性腺的分化和發(fā)育有重要的作用。同時，本實(shí)驗(yàn)還對差異基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果表明Bmp4、Smad2和Smad3調(diào)控Foxl2基因的表達(dá)，對中華鱉卵巢的發(fā)育有著重要的作用。