馮云子，周 婷，吳偉宇，蔡 宇，趙謀明

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，其起源可追溯到我國(guó)周朝時(shí)期，距今已有2 000多年的歷史，是我國(guó)及東南亞各國(guó)飲食文化的重要代表[1]。近年來(lái)，歐美等國(guó)家的醬油消費(fèi)量也逐年增加，醬油已成為世界性的大宗調(diào)味品，年產(chǎn)量約為1 000多萬(wàn)t。醬油主要以大豆、豆粕等植物蛋白為原料，輔以面粉或小麥粉等淀粉質(zhì)原料，在一定鹽濃度條件下，利用微生物(如霉菌、酵母菌、細(xì)菌、乳酸菌等)的發(fā)酵作用，水解原料生成多種氨基酸、肽、有機(jī)酸、糖醇和糖類(lèi)物質(zhì)，并以此為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物化學(xué)變化，形成具有特殊色澤、香氣、滋味和狀態(tài)的調(diào)味液[1-2]。

作為調(diào)味品，醬油的風(fēng)味是其品質(zhì)組成的重要指標(biāo)，更是影響消費(fèi)者嗜好性選擇的關(guān)鍵因素。醬油中香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)可分為以下幾個(gè)維度，如酸香、醇香、麥芽香、花果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類(lèi)香(或烤土豆香)等，不同香型的化合物以一定比例組合形成了醬油濃郁的醬香和酯香[2-3]。在滋味上，醬油具有酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味的綜合味感，其中咸、鮮味較為突出[4]。醬油的風(fēng)味復(fù)雜而平衡，其中揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分是構(gòu)成醬油獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何全面地解析這些成分和確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物并對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)控一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。而在“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要的引領(lǐng)下，人們對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)與健康也提出了更高的要求。有研究表明，除具有獨(dú)特的風(fēng)味外，醬油還富含功能活性物質(zhì)，具有一定的生理功能，如抗氧化[5-6]、抗癌[7-8]、降血壓[9]和提高免疫力[10]等。

本文依據(jù)風(fēng)味和生理功能屬性，分別總結(jié)了醬油中檢出的香氣、滋味以及功能性化合物，并系統(tǒng)闡述了風(fēng)味研究方法的進(jìn)展，探討了研究中存在的問(wèn)題，并對(duì)今后的研究方向提出建議。

1 醬油的風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展

早期醬油風(fēng)味研究多以傳統(tǒng)感官描述結(jié)合基礎(chǔ)理化指標(biāo)為主，但隨著精密儀器和相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，分析風(fēng)味物質(zhì)的能力得到了顯著提升，進(jìn)一步帶動(dòng)了風(fēng)味研究的數(shù)據(jù)信息化，包括定量感官分析、氣(液)相及質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用等；近年來(lái)，精密儀器與感官分析的有機(jī)結(jié)合，更是推動(dòng)了關(guān)鍵風(fēng)味活性化合物的鑒定，其中代表性的研究體系是分子感官組學(xué)，包括GC-O/MS、重組缺失實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，幫助科研工作者從龐大的數(shù)據(jù)系統(tǒng)中關(guān)注到具有代表性的風(fēng)味化合物，明確風(fēng)味調(diào)控的核心目標(biāo)。

1.1 醬油香氣的分析方法研究

香氣物質(zhì)的分析主要分為感官分析和揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個(gè)部分，揮發(fā)性化合物的分析則包括了提取、分離、鑒定、定量以及關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分析，見(jiàn)圖1。

圖1 醬油風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)Fig.1 Detection technology of flavor substances in soy sauce

根據(jù)GB 2717—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 醬油》的規(guī)定，優(yōu)質(zhì)醬油的香氣描述為濃郁的醬香及酯香。因此，早期的感官評(píng)估多以醬香、酯香強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)階段定量描述分析(quantitative descriptive analysis，QDA)技術(shù)[11-12]在研究中使用更為廣泛，醬油常用的香氣標(biāo)度為酸香、醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和烤土豆香等[2-3,12]。QDA方法執(zhí)行期間，需要感官人員提前熟悉每個(gè)香氣特征對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的香氣，如4-乙基愈創(chuàng)木酚(煙熏香)、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或4-羥基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF，焦糖香)，然后對(duì)樣品的特征香氣強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。QDA適用于樣品間差異細(xì)節(jié)的挖掘，以及感官與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)數(shù)據(jù)的結(jié)合分析，但該方法對(duì)感官人員要求相對(duì)較高，需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)長(zhǎng)的訓(xùn)練。

揮發(fā)性化合物的提取是香氣檢測(cè)的重要前提，醬油香氣的提取方法主要包括液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、同時(shí)蒸餾萃取(simultaneous distillation and extraction，SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)、溶劑輔助蒸餾萃取(solvent assisted flavor evaporation，SAFE)和大孔樹(shù)脂吸附等[2-3,13-14]。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)比了LLE、SDE、SPME 3種方法對(duì)醬油香氣分析的影響[2]，發(fā)現(xiàn)LLE適用于半揮發(fā)性化合物的分析，特別是對(duì)呋喃酮和酸類(lèi)物質(zhì)萃取效率較高；SDE分析結(jié)果中醛類(lèi)物質(zhì)含量較高，其提取過(guò)程需要保持樣品沸騰，高溫促使了醬油中的氨基酸、肽與糖類(lèi)物質(zhì)的熱反應(yīng)，生成大量的Strecker醛類(lèi)化合物等[15]，導(dǎo)致分析結(jié)果與醬油真實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異較大，因此SDE并不適合于醬油這一類(lèi)具有較高氨基酸和糖類(lèi)物質(zhì)的食品。無(wú)溶劑萃取技術(shù)SPME近年來(lái)使用越來(lái)越廣泛[12,16]。該方法無(wú)需有機(jī)溶劑，上樣操作簡(jiǎn)單，能有效地萃取揮發(fā)性化合物。但有兩點(diǎn)局限，一是由于目標(biāo)化合物在樣品、頂空和萃取頭中處于三相平衡狀態(tài)，其絕對(duì)定量的準(zhǔn)確度容易受到競(jìng)爭(zhēng)性吸附及基質(zhì)效應(yīng)影響；二是SPME法不適于低揮發(fā)性化合物的分析，比如醬油中的3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮(sotolone)等；為了改善SPME的局限性，新開(kāi)發(fā)的SPME-Arrow萃取技術(shù)[17]，可有效改善萃取頭對(duì)低揮發(fā)性化合物的提取效率，值得在醬油中進(jìn)行應(yīng)用嘗試。此外，SAFE[3]采用高真空、液氮冷凝，可以避免SDE的熱效應(yīng)，較好地還原樣品的實(shí)際香氣特征，同時(shí)避免一些難揮發(fā)性成分進(jìn)入GC-MS影響分離效果。然而，SAFE提取過(guò)程涉及液氮和真空裝置，實(shí)驗(yàn)成本高、設(shè)備操作相對(duì)煩瑣，對(duì)于醬油樣品來(lái)說(shuō)，因其體系以水為主，難揮發(fā)性雜質(zhì)如油脂等含量相對(duì)較低，常規(guī)LLE法也可基本滿足分析測(cè)定。整體而言，不同的方法提取效果和針對(duì)的物質(zhì)各有差異，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)根據(jù)分析的目標(biāo)不同擇優(yōu)選用方法，采用不同方法結(jié)合來(lái)全面分析醬油的香氣化合物也是一個(gè)較為實(shí)用的策略，如采用SPME法和LLE法結(jié)合等。

揮發(fā)性化合物分離和鑒定技術(shù)中，最常用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。在分離上，近年來(lái)多維氣相色譜(GC×GC)的應(yīng)用使得檢出化合物的數(shù)量大大提高，如醬油中可分離的揮發(fā)性化合物從百來(lái)種增加到400余種[18]。而在定性技術(shù)上，可以分為氣相色譜檢測(cè)器(氫火焰離子檢測(cè)器FID、氮磷檢測(cè)器NPD、火焰光度檢測(cè)器FPD、硫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器SCD)，離子遷移譜，及質(zhì)譜等，其中質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量分析器類(lèi)型的不同，又可分為低分辨質(zhì)譜(單四極桿、三重四極桿、離子阱)和高分辨質(zhì)譜(如靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜Orbitrap-MS、飛行時(shí)間質(zhì)譜TOF-MS)。風(fēng)味定性一般需要考慮質(zhì)譜庫(kù)匹配程度、保留指數(shù)(RI)和標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)GC-O嗅聞技術(shù)的研究一般還需要核對(duì)物質(zhì)的香氣特征。關(guān)于醬油風(fēng)味物質(zhì)的系統(tǒng)研究，最早的SCI發(fā)表于1961年，日本Yokotsuka[19]對(duì)日式醬油風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，認(rèn)為愈創(chuàng)木酚化合物是烹調(diào)醬油的特色風(fēng)味成分。到了80年代，Nunomura等[20-22]利用GC-MS技術(shù)從日本醬油酸、中、堿性組分中分離鑒定出93、142及35種揮發(fā)性化合物。隨后的40年間，醬油的風(fēng)味研究得到了迅速的發(fā)展，特別是中國(guó)研究技術(shù)手段的升級(jí)帶來(lái)了傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的理論研究的熱潮。筆者曾對(duì)已報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有近1 038種化合物在醬油中檢出。結(jié)合氣相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(gas chromatography-orbitrap/mass spectrometry)，更是有助于GC-MS/O中未知香氣活性化合物的分析，如貢獻(xiàn)甜香的大馬酮[23]。

氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞儀聯(lián)用技術(shù)(GC-MS/olfactory,GC-MS/O)的發(fā)展使得關(guān)鍵香氣活性化合物的檢測(cè)成為可能。該技術(shù)將GC流出物分成兩部分，一半進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器分析結(jié)構(gòu)，另一半進(jìn)入嗅聞口，以感官人員的鼻子作為檢測(cè)器，感官人員描述嗅聞到的化合物的香氣強(qiáng)度和特點(diǎn)[23]。GC-MS/O方法包括香氣提取稀釋分析(aroma extraction distillation analysis,AEDA)、頻次檢測(cè)法和直接強(qiáng)度法，其中AEDA應(yīng)用最為常見(jiàn)[24-25]。從2004年開(kāi)始，至今為止共有近9個(gè)團(tuán)隊(duì)對(duì)中國(guó)、日本、韓國(guó)、泰國(guó)各種代表性工藝的醬油產(chǎn)品進(jìn)行了深入分析，分別檢出了11～94種香氣活性化合物[3,13,15,18,25-33]。

1.2 揮發(fā)性物質(zhì)和香氣活性化合物研究

醬油中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和數(shù)量繁多，已檢出的1 038種揮發(fā)性化合物[2]主要可分為酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)、呋喃(酮)類(lèi)、吡喃(酮)類(lèi)、吡咯類(lèi)、吡啶類(lèi)、含硫化合物及含氮化合物等13大類(lèi)，其具體的數(shù)量分布見(jiàn)圖2。由圖2可知，酯類(lèi)和醇類(lèi)是檢出數(shù)量較多的類(lèi)別。

圖2 醬油中不同種類(lèi)的揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.2 Number of different kinds of volatile compounds in soy sauce

從2004年開(kāi)始，韓國(guó)的Beak等[26]首次采用固相微萃取-氣相色譜-嗅聞聯(lián)用(SPME-GC-O)對(duì)醬油中關(guān)鍵香氣活性化合物進(jìn)行了分析，描述了11種化合物的香氣特征。迄今為止，研究者們[3,13,15,18,25-33]采用GC-MS/O技術(shù)共在醬油中鑒定出了202種香氣活性化合物，根據(jù)其檢出頻次(≥1次和≥5次)的不同，分別做了統(tǒng)計(jì)總結(jié)，見(jiàn)圖3。由圖3可知，醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、呋喃(酮)類(lèi)、酮類(lèi)是檢出關(guān)鍵香氣活性化合物較多(≥25個(gè))的化合物類(lèi)別。但202個(gè)化合物中沒(méi)有一種物質(zhì)可以完全被描述為“醬油香”或“醬香”，可見(jiàn)醬油的香氣是由多種物質(zhì)按一定比例組成的復(fù)雜香氣組合。

圖3 醬油中不同種類(lèi)香氣活性化合物的數(shù)量Fig.3 Number of different kinds of aroma-active compounds in soy sauce

表1及圖4重點(diǎn)列舉了醬油中高頻檢出(≥5次)的31種香氣活性化合物及其香氣描述詞、強(qiáng)度和檢出頻次。根據(jù)香氣描述詞大致可歸納為酸醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類(lèi)香8種香型。

圖4 醬油中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物Fig.4 Key flavor compounds in soy sauce

表1 醬油中檢出頻次大于等于5的香氣活性化合物Tab.1 Aroma-active compounds with detection frequency greater than or equal to 5 times in soy sauce

1.2.1酸香和醇香物質(zhì)

醬油中的酸香主要由低分子量的揮發(fā)性酸構(gòu)成，如乙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸。酸類(lèi)物質(zhì)能使發(fā)酵環(huán)境的pH值下降，為酵母的生長(zhǎng)和發(fā)育提供酸性環(huán)境，同時(shí)，可與醇類(lèi)發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類(lèi)化合物，對(duì)香氣和口感起著重要作用。醬油中乙酸含量較高，一般可達(dá)到1～10 mg/L，但其閾值相對(duì)較高(22 mg/L)[2-3]；相比之下，2/3-甲基丁酸的含量需要在發(fā)酵過(guò)程中有所控制，過(guò)高會(huì)產(chǎn)生“汗味”“臭襪子味”等異味，影響醬油品質(zhì)。

乙醇是醬油醇類(lèi)中含量最高的揮發(fā)性化合物，一般含量為3 000～10 000 mg/L[1,3]。日式醬油的醇香顯著強(qiáng)于中式醬油，這與其發(fā)酵工藝中酵母的代謝密切相關(guān)，部分產(chǎn)品還有添加乙醇，以提高醬油的防腐性能[1]。

1.2.2麥芽香物質(zhì)

2/3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醛和2/3-甲基丁醛是醬油“麥芽香”的重要來(lái)源，該類(lèi)物質(zhì)與氨基酸的代謝關(guān)系密切，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，這一類(lèi)氨基酸前體的廣泛存在，使得它們?cè)诙喾N食品中都具有香氣活性，如大豆醬[34]、黑巧克力等。

1.2.3花香和果香物質(zhì)

在花香特征上，苯乙醇和苯乙醛是主要的貢獻(xiàn)者，具有“花香”“甜香”和“蜂蜜香”，與苯丙氨酸的代謝相關(guān)，兩者在醬油中平均香氣強(qiáng)度達(dá)到3.6，檢出頻次超過(guò)80%，是醬油中重要的香氣物質(zhì)，也在很多食品(如奶酪、面包和紅酒)中被鑒定為關(guān)鍵香氣活性化合物[35]，同時(shí)也是花朵芬芳的重要來(lái)源。

醬油中果香與乙酯類(lèi)化合物密切相關(guān)，主要包括乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯和異丁酸乙酯，特別是異丁酸乙酯，具有特征的蘋(píng)果香味，帶給醬油濃郁而柔和的特征[1]，但在低分辨MS的鑒定中異丁酸乙酯容易被前一個(gè)物質(zhì)覆蓋，利用高分辨質(zhì)譜結(jié)合解卷積可以有效鑒定該物質(zhì)[23]。在日式醬油中乙酯類(lèi)化合物的含量相對(duì)中式醬油更高[31]，約為中式醬油的4～5倍，使得日式醬油具有較為濃郁的果香，這與酵母的代謝活動(dòng)有關(guān)。

1.2.4焦糖香物質(zhì)

由表1可知，焦糖香化合物平均香氣強(qiáng)度為3.4分，平均檢出頻次達(dá)到64%，是醬油重要的香氣特征之一，其物質(zhì)基礎(chǔ)是HEMF、HDMF、麥芽酚和sotolone等，這些化合物的分子結(jié)構(gòu)特征均是環(huán)酮分子中含有烯醇化的結(jié)構(gòu)單元[2]。焦糖香氣物質(zhì)中，檢出頻次最高的物質(zhì)為HEMF，俗稱醬油酮，在GC-MS檢測(cè)時(shí)，這個(gè)物質(zhì)一般能檢出2個(gè)同分異構(gòu)體，包括4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和4-羥基-5-乙基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮，典型離子碎片為142 m/z。本研究團(tuán)隊(duì)曾調(diào)查了27種商業(yè)醬油的香氣活性化合物，HEMF在醬油的所有香氣活性化合物中，平均OAV值排第二，最高可達(dá)到2 163[36]。此外，sotolone的檢出頻次為焦糖香化合物中最低，但其平均香氣強(qiáng)度排名第一，這可能與其揮發(fā)特性及檢測(cè)方法的選用有關(guān)，該物質(zhì)除貢獻(xiàn)焦糖香外，還常被描述為調(diào)味品香[2-3]。

1.2.5煙熏香物質(zhì)

煙熏香化合物檢出頻次達(dá)到71%，2,6-二甲氧基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚這4種甲氧基酚類(lèi)化合物是最主要的貢獻(xiàn)者，常被描述為“煙熏”“焦香”及“培根”等[3,12]。該類(lèi)化合物檢出最多的4-乙基愈創(chuàng)木酚具有強(qiáng)烈的煙熏香和培根香，是日韓醬油香氣的重要貢獻(xiàn)化合物。

1.2.6烘烤香物質(zhì)

貢獻(xiàn)烘烤香的物質(zhì)主要是吡嗪類(lèi)化合物，常檢出的有2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，吡嗪類(lèi)化合物是含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的一類(lèi)化合物的總稱，經(jīng)常在堅(jiān)果、芝麻和花生等焙烤食品中發(fā)現(xiàn)，貢獻(xiàn)著烘烤香和堅(jiān)果香[2-3]。該類(lèi)物質(zhì)在醬油中具有中等香氣強(qiáng)度(2.7分)，檢出頻次較低。這與醬油中常檢出的幾類(lèi)吡嗪類(lèi)化合物閾值較高是有關(guān)系的，前期對(duì)商業(yè)醬油的研究中發(fā)現(xiàn)其OAV值都小于1[36]。

1.2.7蔬菜香物質(zhì)

蔬菜香型包括“蘑菇香”“煮熟的洋蔥味”和“烤土豆味”等，具有較高的香氣強(qiáng)度(3.1分)，且檢出頻次達(dá)到68%。1-辛烯-3-醇具有類(lèi)似蘑菇的香氣，也被稱之為蘑菇醇。二甲基三硫除了貢獻(xiàn)“煮熟的洋蔥味”，還貢獻(xiàn)“硫黃味”?！翱就炼刮丁庇袃蓚€(gè)典型的化合物，即3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇，而3-甲硫基丙醛是醬油[3]和豆醬[34]等發(fā)酵豆制品中常見(jiàn)的香氣活性化合物。二甲基三硫、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇是醬油中最常檢出的含硫化合物，雖然含量不高，但具有較低的閾值[2]，故具有較強(qiáng)的香氣貢獻(xiàn)。

2 醬油的滋味物質(zhì)研究進(jìn)展

2.1 醬油滋味的分析方法研究

醬油的滋味具有五味調(diào)和、咸鮮突出的特點(diǎn)，其基本研究思路與香氣類(lèi)似，也包括感官和非揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個(gè)部分(圖1)。感官分析一般采用人來(lái)評(píng)價(jià)醬油的滋味特點(diǎn)，但其鹽濃度常高達(dá)16%～18%，感官分析難度較高。近年來(lái)，電子舌技術(shù)也被引入到醬油滋味的研究中，通過(guò)馴化建立模型，可以用來(lái)輔助醬油調(diào)配工作[37]。同時(shí)，隨著分離和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，非揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定種類(lèi)也與日俱增，關(guān)注對(duì)象從乳酸、谷氨酸等，逐漸擴(kuò)展到了糖類(lèi)、氨基酸、肽和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等，代謝組學(xué)思想的引入更是為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的科學(xué)發(fā)展注入了新力量。

采用HPLC和氨基酸分析儀，一般能從醬油中檢測(cè)到15～18種氨基酸[4,38-39]和7～10種糖類(lèi)物質(zhì)。隨后，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、LC-MS、UPLC-MS/MS、GC-MS衍生化等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，進(jìn)一步揭秘了醬油的物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者和團(tuán)隊(duì)成員曾優(yōu)化并采用以上幾種技術(shù)研究醬油的小分子代謝物質(zhì)，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，總結(jié)發(fā)現(xiàn)，NMR和GC-MS衍生化適合于初級(jí)代謝產(chǎn)物(糖、糖醇、有機(jī)酸等)的檢測(cè)，而LC-MS和UPLC-MS/MS相對(duì)更適合次級(jí)代謝產(chǎn)物和肽類(lèi)物質(zhì)的分析，也包括一系列氨基酸和肽的衍生物。Kamal等[40]和林涵玉[41]采用 NMR 技術(shù)分別從醬油中檢測(cè)到 18、24種非揮發(fā)性化合物，而GC-MS結(jié)合衍生化法[42-43]，可鑒定出50～100種化合物，包括糖、氨基酸、糖醇、有機(jī)酸、核苷酸等；UPLC-MS/MS技術(shù)的應(yīng)用，將物質(zhì)鑒定數(shù)量更是提高到了155～427種[44-46]。

關(guān)鍵滋味化合物的分析也隨著分子感官科學(xué)的不斷革新有了新的進(jìn)展，主要包括以下幾方面的技術(shù)。QDA表征醬油酸甜苦咸鮮以及濃厚六個(gè)維度的滋味強(qiáng)度，為分析滋味物質(zhì)基礎(chǔ)打下了良好的基礎(chǔ)。此外，滋味稀釋分析(TDA)[47]是一種基于凝膠色譜、HPLC分離，并通過(guò)感官分析連續(xù)稀釋級(jí)分，以在食品復(fù)雜的混合物中鑒定出最強(qiáng)烈的滋味化合物的技術(shù)，它的應(yīng)用是食品關(guān)鍵滋味活性化合物分析的里程碑[48]。本團(tuán)隊(duì)采用該方法從醬油中鑒定得到了15條鮮味肽[49-50]，然而該類(lèi)方法工作量大，研究周期相對(duì)較長(zhǎng)。此外，重組、缺失實(shí)驗(yàn)也被應(yīng)用到紅酒[51]和綠茶[52]上，用于鑒定其關(guān)鍵滋味化合物，而醬油中非揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和數(shù)量眾多，如何將這一些技術(shù)更好地應(yīng)用于醬油值得關(guān)注。

2.2 非揮發(fā)性化合物和滋味化合物研究

對(duì)已發(fā)表的文獻(xiàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在醬油中共檢測(cè)到230種非揮發(fā)性化合物，包括90種肽、49種有機(jī)酸、27種氨基酸及其衍生物、28種糖、11種糖醇、6種生物胺、4種核苷酸和16種其他類(lèi)化合物，結(jié)果見(jiàn)圖5，這些物質(zhì)分別構(gòu)成了醬油的酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味。

圖5 醬油中不同種類(lèi)非揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.5 Number of different types of non-volatile compounds in soy sauce

2.2.1酸味物質(zhì)

醬油的酸味主要貢獻(xiàn)者是種類(lèi)繁多的有機(jī)酸，包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的。非揮發(fā)性有機(jī)酸主要有乳酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等[41]。有機(jī)酸可以調(diào)和醬油的風(fēng)味，如乳酸可以賦予醬油圓潤(rùn)綿長(zhǎng)的口感，在醬油風(fēng)味中能夠緩解咸味[1]，而Kong等[53]發(fā)現(xiàn)，乳酸和焦谷氨酸能夠平衡中式醬油的滋味。

2.2.2甜味物質(zhì)

醬油甜味的主要來(lái)源是糖類(lèi)物質(zhì)，如葡萄糖、半乳糖和果糖等單糖[54]，他們來(lái)自原料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水解，此外，也有在調(diào)配過(guò)程中加入的蔗糖。早期采用HPLC等分離鑒定醬油中的糖類(lèi)，而GC-MS衍生化法的應(yīng)用，可從醬油中鑒定出14～23種糖和糖醇類(lèi)化合物[41,55]，糖醇類(lèi)化合物的滋味貢獻(xiàn)早期報(bào)道較少，如赤蘚糖醇、半乳糖醇、木糖醇和核糖醇等，值得進(jìn)一步探討。

除糖與糖醇類(lèi)以外，還有一類(lèi)弱疏水性的氨基酸化合物為醬油貢獻(xiàn)甜味，如丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等，其中丙氨酸具有較強(qiáng)的甜味，在中式和日式醬油中其濃度分別為丙氨酸呈味閾值(60 mg/100 mL)的2.9倍和6.2倍[4]。

2.2.3苦味物質(zhì)

氨基酸的滋味與其側(cè)鏈密切相關(guān)，當(dāng)氨基酸具有強(qiáng)疏水性時(shí)，大多數(shù)具有苦味，如組氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。除此之外，還有多酚和部分的肽呈苦味，如崔春等[56]在2019年報(bào)道的醬油中16條小肽(分子質(zhì)量<1 000 Da，富含疏水性氨基酸)。本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這些苦味物質(zhì)及其衍生物在適宜的濃度范圍內(nèi)，可能對(duì)醬油的濃厚味感具有積極的影響。

2.2.4咸味物質(zhì)

高濃度的NaCl(12%～18%)是醬油咸味特征的來(lái)源，是醬油中除水以外含量最高的化合物。在發(fā)酵過(guò)程中，高濃度的鹽能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)，從而保證了醬油的風(fēng)味和品質(zhì)。近年來(lái)，減鹽醬油的開(kāi)發(fā)也成為熱潮，如何在發(fā)酵過(guò)程采用控溫、微生物添加等技術(shù)來(lái)保證減鹽醬油的風(fēng)味品質(zhì)和安全生產(chǎn)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

2.2.5鮮味物質(zhì)

醬油鮮味是其最重要的滋味特征，鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸一直是關(guān)注的重點(diǎn)，主要來(lái)源于蛋白質(zhì)的分解，也有部分來(lái)源于調(diào)配階段所加入的鮮味劑——谷氨酸鈉。這也是醬油品質(zhì)指標(biāo)氨基酸態(tài)氮所反映的內(nèi)涵之一。此外，部分有機(jī)酸也具有增鮮作用，如琥珀酸[1]。

然而，以上單體物質(zhì)的重組體系與醬油的鮮味輪廓仍有一定差距，隨著分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)，食品中肽組分具有呈鮮或增強(qiáng)鮮味感知的能力。據(jù)Tamura等[57]發(fā)表于1989年的一份研究報(bào)告，從牛肉湯中分離鑒定得到一條呈鮮味的八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala，在pH值6.5時(shí)其鮮味強(qiáng)度與谷氨酸鈉相當(dāng)，然而后期Van Wassenaar等[58]和Hau[59]報(bào)道的結(jié)果與之有所矛盾。這些報(bào)道拉開(kāi)了呈味肽研究的序幕，2004年，Lioe等[38]研究了醬油中的呈味肽段，發(fā)現(xiàn)<500 Da的醬油組分鮮味最強(qiáng)。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展解決了肽段結(jié)構(gòu)的解析難題，Yamamoto等[43]通過(guò)數(shù)學(xué)模型分析了醬油中237個(gè)二肽與滋味之間的相關(guān)性，得到5條與鮮味高度相關(guān)的二肽。本團(tuán)隊(duì)也采用不同的分離技術(shù)從醬油中分離出了鮮味肽，并分別鑒定了5條和10條鮮味肽結(jié)構(gòu)[49-50]。

醬油的鮮味研究并不止步于此，還有更多的鮮味及鮮味增強(qiáng)物質(zhì)在不斷地被發(fā)現(xiàn)。2014年，Shiga等[45]在醬油中發(fā)現(xiàn)了一種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物N-(1-deoxyfructos-1-yl)glutamic acid(Fru-Glu)，其鮮味強(qiáng)度高于對(duì)應(yīng)濃度的谷氨酸。此外，F(xiàn)ru-pGlu、Fru-Val、pGlu-Gln、pGlu-Val、Lac-Glu、Lac-Leu等一系列氨基酸衍生物的新發(fā)現(xiàn)為醬油研究打開(kāi)了新方向，部分物質(zhì)已經(jīng)被驗(yàn)證具有鮮味增強(qiáng)作用[44,60-61]。由此可見(jiàn)，醬油鮮味的秘密還未完全解開(kāi)，仍值得深入探索。

2.2.6濃厚味物質(zhì)

酸甜苦咸鮮五種基本滋味無(wú)法全面概括醬油的滋味特征。Ueda等[62]在1990提出了一種新的滋味屬性 “kokumi”(濃厚味)，是一種綿延感、飽滿感和厚重感的綜合味感，他們的研究表明：大蒜水提取物中的含硫化合物，特別是谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)能夠增強(qiáng) kokumi 味。2013年，Kuroda等[46]首次證實(shí)醬油中存在γ-Glu-Val-Gly，說(shuō)明醬油的kokumi味可能與其肽及相關(guān)衍生物關(guān)系密切。

2.3 香氣與滋味的交互作用研究

風(fēng)味物質(zhì)的組成及其之間的相互作用共同決定了醬油的風(fēng)味效果。近些年來(lái)，研究人員關(guān)注到醬油的香氣對(duì)滋味感知也有影響。Onuma等[63]和Chokumnoyporn等[64]研究發(fā)現(xiàn)將醬油香氣添加到NaCl溶液和食品體系中可以增強(qiáng)其咸味感知。為了進(jìn)一步探明互作的物質(zhì)基礎(chǔ)，本團(tuán)隊(duì)采用氣相色譜-嗅聞/與滋味相關(guān)(GC-O/AT)技術(shù)明確了醬油中與咸/鮮味相關(guān)的香氣化合物，發(fā)現(xiàn)香氣與滋味特征存在一致性，并且3-甲硫基丙醛具有最強(qiáng)的增咸和增鮮作用[33]。醬油的滋味與滋味之間也存在交互作用。Imamura等[65]研究發(fā)現(xiàn)醬油中一種多糖能夠抑制鮮味回味，Kim等[66]在韓國(guó)醬油中分離得到的F05鮮味活性組分，能夠掩蔽部分苦味。未來(lái)，食品的風(fēng)味交互作用仍有大量的空白區(qū)域值得深入探索。

3 醬油的生理活性物質(zhì)及功能特性

醬油中富含諸如類(lèi)黑精、呋喃類(lèi)化合物、異黃酮類(lèi)化合物、大豆多肽等生理活性物質(zhì)，使得醬油在起到調(diào)味作用的同時(shí)也具有較好的功能特性，如抗氧化、抗癌、降血壓、降尿酸、抗過(guò)敏、抗血小板產(chǎn)生、抗白內(nèi)障等，其中前3種活性物質(zhì)的功能研究較為深入，甚至在臨床中已有應(yīng)用?，F(xiàn)將研究中發(fā)現(xiàn)的醬油生理活性物質(zhì)及功能特性歸納于表2。

表2 醬油生理活性物質(zhì)及功能研究總結(jié)Tab.2 Summary of researches on physiological active substances and their functions in soy sauce

3.1 抗氧化方面的作用

通過(guò)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，醬油是一種極為有效的抗氧化劑[6,80]，新加坡國(guó)立大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)醬油相對(duì)于咖喱醬、料酒等多種亞洲調(diào)味料，其抗氧化活性具有明顯優(yōu)勢(shì)，特別是老抽，約為紅酒抗氧化活力的10倍左右。這與Li等[5]的研究結(jié)果相符，通過(guò)對(duì)41種市售醬油的基本成分和抗氧化活性分析，也發(fā)現(xiàn)老抽具有最高的抗氧化活性，PLS回歸分析表明醬油的抗氧化活性與褐變指數(shù)密切相關(guān)；Wang等[67]發(fā)現(xiàn)麥芽酚和類(lèi)黑精等含碳水化合物的色素是醬油具有高抗氧化能力的主要原因。

此外，大豆異黃酮的抗氧化活性也常常被關(guān)注，其可作用于氧自由基和脂過(guò)氧化物以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[81]。Kinoshita等[71]利用HPLC從發(fā)酵醬油中分離得到了3種異黃酮衍生物，鑒定為大豆素、染料木素與8-羥基染料木素的衍生物；本團(tuán)隊(duì)采用UPLC-MS/MS揭示了15種大豆異黃酮在醬油制曲和醬醪發(fā)酵全過(guò)程的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大豆異黃酮從苷類(lèi)異黃酮逐漸轉(zhuǎn)化為高活性的苷元類(lèi)黃酮以及羥基異黃酮，且在發(fā)酵過(guò)程中，羥基大豆苷元的抗氧化活力貢獻(xiàn)約為大豆苷元的100～500倍，屬于“少量關(guān)鍵”的功能性物質(zhì)。Kataoka等[68]的實(shí)驗(yàn)表明HEMF、HDMF、HMF這類(lèi)呋喃酮類(lèi)化合物具有抗氧化作用，且發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF比抗壞血酸的抗氧化效果更好，其活性分別為抗壞血酸的1.52倍和1.28倍；Chen等[69]通過(guò)分離純化大豆蛋白水解物和硫氰酸鐵法將多肽Leu-Leu-Pro-His-His判定為抗氧化肽；Yang等[70]發(fā)現(xiàn)醬糟蛋白水解物的抗氧化活性較佳，可能與其抗氧化氨基酸Try、Met、His、Lys和Trp含量較高有關(guān)。

3.2 抗癌方面的作用

醬油中活性成分的抗癌作用與抗氧化作用具有相關(guān)性[82]，如異黃酮和呋喃酮等。大豆苷被發(fā)現(xiàn)對(duì)ZR-75-1乳癌具有抗增殖的作用，而染料木苷與哺乳動(dòng)物腫瘤減少有著極大的相關(guān)性[83]；醬油中含有的呋喃酮類(lèi)化合物也具有抗癌作用，Nagahara等[8]早在1991年便驗(yàn)證了HEMF能抑制BP 誘導(dǎo)老鼠胃瘤形成，此后Kataoka等[68]在1997年證實(shí)了HMF和HDMF具有同樣的效果，其中HDMF是抗癌能力最強(qiáng)的成分。此外，威斯康星大學(xué)食品研究所發(fā)現(xiàn)醬油中含有的綴合亞油酸能有效地抑制皮膚癌和胃癌[84]；李瑩等[7]采用柱層析色譜分離技術(shù)從發(fā)酵醬油弱極性部分中分離鑒定出了4種具有醌還原酶(QR)誘導(dǎo)活性的化合物，進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅱ相酶從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的預(yù)防作用[85]，主要包括兒茶酚、大豆苷元、flazin和perlolyrin。

3.3 降血壓方面的作用

對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制效果為評(píng)估降血壓活性的常用指標(biāo)。黃驪虹[72]研究表明大豆多肽可抑制ACE的作用；Hata等[86]和Kawasaki等[73]陸續(xù)發(fā)現(xiàn)無(wú)鹽醬油中部分肽段如Ile-Pro-Pro、Val-Pro-Pro和Val-Tyr對(duì)于輕度高血壓患者具有降壓作用。此外，Kinoshita等[9]在醬油中發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性的成分——煙酰胺。

3.4 降尿酸方面的作用

Li等[74]發(fā)現(xiàn)醬油(1.8 mL/kg)可以有效降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血清中的尿酸水平，并認(rèn)為降低血清尿酸水平的機(jī)制之一可能是抑制了血清黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性。隨后其以XOD抑制活性為導(dǎo)向，通過(guò)硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備HPLC分離等一系列的方法從醬油中分離純化得到10種活性化合物，其中flazin的XOD抑制活性最強(qiáng)，且為首次報(bào)道，IC50值為0.51 mM，其次，鄰苯二酚、染料木素和3,4-二羥基肉桂酸乙酯均有較強(qiáng)的XOD抑制活性，作者還進(jìn)一步揭示了這些關(guān)鍵活性化合物的作用機(jī)制和相互作用。

3.5 其他方面的作用

Kobayashi[10]發(fā)現(xiàn)醬油多糖具有抗過(guò)敏的作用；Sasaki等[75]發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF和HMF在具有抗氧化和抗癌作用的同時(shí)，還兼具抗白內(nèi)障的作用。除此之外，醬油中的活性成分還具有促進(jìn)胃液分泌、抗貧血及降血脂的作用。

4 展 望

整體而言，關(guān)于醬油的風(fēng)味物質(zhì)和功能活性已有大量研究報(bào)道，關(guān)鍵物質(zhì)的揭示將為其品質(zhì)調(diào)控提供明確的目標(biāo)和方向，如何全面地解析這些成分、確定關(guān)鍵活性化合物，并對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)控，一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，未來(lái)仍有許多值得深入探索的地方，如醬油鮮味的秘密，如何進(jìn)一步挖掘增鮮肽等鮮味物質(zhì)基礎(chǔ)并定向調(diào)控富集，風(fēng)味的交互作用如何影響醬油的產(chǎn)品品質(zhì)，以及醬油風(fēng)味功能菌的分離鑒定、交互研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，都是醬油企業(yè)及傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)需要繼續(xù)關(guān)注的研究方向。相信隨著檢測(cè)技術(shù)和分析方法的不斷發(fā)展，基于多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合的釀造工藝升級(jí)和品質(zhì)定向調(diào)控將不斷突破，更有利于系統(tǒng)解密醬油釀造，進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的調(diào)控效果。