胰蛋白酶制備烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的研究

周勰 葉捷娜 張林佳 黃芳芳 楊最素

摘要 [目的]探討胰蛋白酶制備烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的工藝及體外抗氧化活性。[方法]以烏賊纏卵腺為原料，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽的提取工藝;將酶解液超濾分成4個(gè)分子段，通過(guò)體外檢測(cè)DPPH清除率、·OH清除率和還原力評(píng)價(jià)其抗氧化活性。[結(jié)果]胰蛋白酶酶解烏賊纏卵腺在加酶量2 000 U/g、pH為8.5、料液比1∶3、酶解時(shí)間8 h條件下得到的酶解物對(duì)DPPH的清除率最大。酶解液經(jīng)超濾得到的<3 kD分子段的多肽具有良好的DPPH清除能力、·OH清除能力和還原能力。[結(jié)論]胰蛋白酶酶解制備的烏賊纏卵腺多肽具有較好的體外抗氧化活性，可作為抗氧化肽的理想來(lái)源。

關(guān)鍵詞 烏賊纏卵腺;多肽;胰蛋白酶;酶解;抗氧化活性

中圖分類號(hào) TS 254.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.049?? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Preparation of Antioxidant Activity Polypeptide from Cuttlefish Ovary Gland by Trypsin

ZHOU Xie，YE Jie-na，ZHANG Lin-jia et al （Zhejiang Engineering Research Center for Marine Biomedical Products，School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract [Objective] To explore the conditions for the preparation of antioxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin and study the antioxidant activities of the enzymatic hydrolysates ?in vitro. [Method] The nidamental glands of cuttlefish were used as raw materials and hydrolyzed by trypsin.Single-factor and orthogonal tests were used to optimize the extraction process for anti-oxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish.The enzyme hydrolysate was ultrafiltered into 4 molecular segments，and its antioxidant activity was evaluated by ?in vitro ?detection of DPPH clearance rate，·OH clearance rate and reducing power.[Result] The optimized conditions were as follows： volume of enzyme of 2 000 U/g，pH of 8.5，solid-liquid ratio of 1∶3 and hydrolysis time of 8 h.Peptides with a Mw of less than 3 kD exhibited appreciable antioxidant activities，including DPPH scavenging，·OH scavenging and reducing activities.[Conclusion]The peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin had excellent antioxidant activities ?in vitro ?and could be an ideal source of antioxidant peptides.

Key words Nidamental gland of cuttlefish;Peptides;Trypsin;Enzymatic hydrolysis;Antioxidant activity

人體內(nèi)自由基的生成和清除一般處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，過(guò)多的自由基會(huì)干擾這種平衡，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并引起炎癥、糖尿病等疾病[1]?；瘜W(xué)合成的抗氧化劑已普遍應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品、日用化妝品和食品等行業(yè)[2]。然而化學(xué)合成的抗氧化劑對(duì)人體健康有潛在的毒性，因此，開(kāi)發(fā)安全有效的天然抗氧化劑已引起人們的廣泛關(guān)注[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多動(dòng)植物來(lái)源的多肽已被證實(shí)具有清除自由基的能力[4]，這為開(kāi)發(fā)新型抗氧化劑提供了新的思路。研究表明，通過(guò)酶解大分子蛋白得到的抗氧化肽通常具有抗氧化活性強(qiáng)、生物安全性等優(yōu)勢(shì)[5]。海洋蛋白是制備抗氧化活性肽的高質(zhì)量原料。鮑魚(yú)內(nèi)臟、鯉魚(yú)魚(yú)鱗等海洋生物蛋白已被報(bào)道用于制備具有良好抗氧化活性的多肽[6-7]。

烏賊肉質(zhì)細(xì)膩脆口、營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有很高的醫(yī)用價(jià)值，備受消費(fèi)者青睞。但在烏賊加工的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生烏賊內(nèi)臟、烏賊皮、烏賊墨和烏賊骨等大量副產(chǎn)物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)從這些副產(chǎn)物中可以提取大量的具有抗氧化、抗炎等活性的產(chǎn)物[8]。烏賊纏卵腺作為烏賊加工的副產(chǎn)物之一，已被報(bào)道用于制備具有抗疲勞、提高免疫功能的生物活性物質(zhì)[9]。烏賊纏卵腺的舍棄是對(duì)蛋白質(zhì)資源的一種極大耗損。該研究通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化胰蛋白酶酶解烏賊纏卵腺制備抗氧化肽的工藝，并通過(guò)測(cè)定DPPH清除率、·OH清除率以及還原力探究不同分子量酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 新鮮雌烏賊內(nèi)臟，購(gòu)自舟山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。胰蛋白酶（酶活250 U/g），購(gòu)自北京亞太恒信生物科技有限公司;DPPH、鐵氰化鉀、鄰二氮菲，購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 HWS-24數(shù)顯恒溫水浴鍋（山東城創(chuàng)新儀器有限公司）;Cogent u Scale超濾系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）;pHS-250 pH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）;UV-1600PC紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)解儀器有限公司）;CF16RN高速冷凍離心機(jī)（日立儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 烏賊纏卵腺抗氧化活性肽制備工藝。取烏賊纏卵腺，去除周圍其他組織，搗碎成勻漿液→調(diào)料液比→調(diào)pH→胰蛋白酶酶解（37 ℃）→滅酶活（沸水浴10 min）→離心（12 000 r/min，15 min）→取上清液→冷凍干燥。

1.3.2 單因素試驗(yàn)。該試驗(yàn)以加酶量（1 000、1 500、2 000和2 500 U/g）、pH（7.5、8.0、8.5和9.0）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3和1∶4）和酶解時(shí)間（2、4、6和8 h）為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以游離氨基氮（ANN）含量為指標(biāo)，來(lái)確定胰蛋白酶酶解的條件范圍。該試驗(yàn)除被考察的單因素外，其他3因素均為相同的固定值（加酶量為1 500 U/g、pH為8.0、料液比為1∶3、酶解時(shí)間為8 h）。ANN含量與水解度呈正相關(guān)。ANN含量用甲醛電位滴定法測(cè)定[10]。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽提取工藝。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，考慮到pH、時(shí)間、加酶量、料液比4個(gè)因素，選取L 9（34）正交試驗(yàn)記錄表，以DPPH清除率評(píng)價(jià)酶解液的抗氧化活性。因素和水平見(jiàn)表1。

1.3.4 超濾截留。取冷凍干燥的烏賊纏卵腺酶解液，用超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾分段，得到4個(gè)不同分子段的提取液，分別為<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。將各分子段的超濾液進(jìn)行冷凍干燥，測(cè)定其體外抗氧化活性。

1.3.5 體外抗氧化能力的測(cè)定。DPPH清除率[11]、·OH清除率[12]、還原力[13]的檢測(cè)參照文獻(xiàn)進(jìn)行并適當(dāng)改進(jìn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 加酶量對(duì)烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖1可以看出，隨著胰蛋白酶添加量的持續(xù)增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在加酶量為2 000 U/g時(shí)，ANN含量到達(dá)最高值。當(dāng)加入少量胰蛋白酶時(shí)，底物會(huì)和胰蛋白酶充分結(jié)合，加酶量越大，底物水解越充分。但當(dāng)胰蛋白酶超過(guò)一定量后，過(guò)多的酶分子會(huì)抑制中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物[10]。因此選擇加酶量1 500、2 000、2 500 U/g進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.2 pH對(duì)烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖2可以看出，隨pH的增加，酶解物的ANN含量先增加后降低。胰蛋白酶的pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，從而影響底物的水解[14]。因此選擇pH為7.5、8.0、8.5進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.3 料液比對(duì)烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖3可以看出，當(dāng)料液比持續(xù)增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在料液比為1∶3時(shí)，酶解物的ANN含量到達(dá)最高值。這可能是因?yàn)槊附膺^(guò)程中較小的料液比使底物濃度降低，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)的速度降低，酶解產(chǎn)物減少。因此選擇料液比為1∶1、1∶2、1∶3進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)烏賊纏卵腺酶解物的ANN含量的影響。從圖4可以看出，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解物的ANN含量越高。當(dāng)酶解時(shí)間為8 h時(shí)，酶解物的ANN含量最高。所以選擇酶解時(shí)間為4、6、8 h進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn) 為進(jìn)一步優(yōu)化烏賊纏卵腺抗氧化活性肽的制備工藝，進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，影響胰蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH清除率的各因素排序?yàn)镈>A>C>B，即酶解時(shí)間>加酶量>料液比>pH，其中酶解時(shí)間的影響最大，pH的影響最小。在組合為A 2B 3C 3D 3即加酶量為2 000 U/g、pH為8.5、料液比為1∶3、酶解時(shí)間為8 h時(shí)，酶解物的DPPH清除率最高。

2.3 超濾截留 通過(guò)超濾將烏賊纏卵腺的酶解物分為分子量<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD的多肽，其抗氧化能力如圖5所示。與其他超濾組分相比，<3 kD的組分具有最高的DPPH清除率、·OH清除率和還原力。研究表明，低分子量的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[15]。因此，選擇分子量<3 kD的組分用于后續(xù)抗氧化活性的評(píng)估。

2.4 抗氧化活性的評(píng)估

2.4.1 DPPH清除率的測(cè)定。由圖6可知，<3 kD分子段多肽隨著其濃度的升高，DPPH清除率也升高;當(dāng)多肽濃度為16 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大，最大清除率為90.95%。而陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸（V C）的DPPH清除率都在95%～100%。所以<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽具有良好的DPPH清除能力。

2.4.2 ·OH清除率的測(cè)定。由圖7可知，陽(yáng)性對(duì)照V C組隨濃度的增加，其對(duì)·OH的清除率增加，增加幅度較大;當(dāng)V C濃度為16 mg/mL時(shí)，·OH清除率最大達(dá)到84.07%。<3 kD 分子段多肽隨濃度的增加，·OH清除率也呈上升趨勢(shì)，在多肽濃度為16 mg/mL時(shí)達(dá)到最大清除率63.61%，但其增加幅度較陽(yáng)性對(duì)照組低。因此<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽具有較好的·OH清除率。

2.4.3 還原力的測(cè)定。由圖8可知，<3 kD分子段多肽隨著濃度的升高，其還原力值逐漸升高。在濃度為16 mg/mL時(shí)，還原力達(dá)到最大值（0.284）。但同等濃度下的抗壞血酸的還原能力要強(qiáng)于<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽的能力。因此<3 kD的烏賊纏卵腺抗氧化肽有較好的還原能力。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)篩選出胰蛋白酶提取烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽的最優(yōu)條件：加酶量為2 000 U/g，pH為8.5，料液比為1∶3，酶解時(shí)間為8 h。酶解液通過(guò)超濾得到4個(gè)不同分子段，分別為<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。通過(guò)檢測(cè)DPPH清除率、·OH清除率和還原力，發(fā)現(xiàn)<3 kD分子段多肽具有最佳的抗氧化活性。該研究結(jié)果表明烏賊纏卵腺抗氧化活性多肽具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，在生物醫(yī)學(xué)、日用化妝品和食品行業(yè)有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

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