李娜，陳晟，吳敬*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

麥芽糊精具有良好的吸水性、持水性、膨脹性、黏彈性和成膜性，因此常作為改良劑被應(yīng)用到蛋糕或面包等烘焙產(chǎn)品中[1-2]，用以改善烘焙產(chǎn)品品質(zhì)[3]。但隨著消費(fèi)者對面包烘焙食品品質(zhì)要求的不斷提高，開發(fā)應(yīng)用效果良好的改性麥芽糊精逐漸成為熱點(diǎn)[4]。相關(guān)研究表明，改性麥芽糊精應(yīng)用于面包品質(zhì)改良時(shí)，能有效降低面包硬度，延緩老化回生[5-7]。

因此，本文選用能特異性轉(zhuǎn)移DP6～10麥芽寡糖的分支酶[8]，與能夠轉(zhuǎn)移單個(gè)葡萄糖生成連續(xù)α-1,6-糖苷鍵連接異麥芽多糖的4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶[9-10]相結(jié)合，通過雙酶復(fù)配來制備一種分支鏈長、特異性強(qiáng)、分支度高且密集的改性麥芽糊精，其在面包質(zhì)地改善方面的應(yīng)用效果良好。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)中選用的分支酶CyBE來源于Cyanothecesp.ATCC 51142，2種4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶GTF5和GTF13分別為來源于Bacillussporothermodurans和Lactobacillusfermentum。產(chǎn)3種來源酶的重組菌株，均為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保藏。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加20 g/L的瓊脂。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 24.0，胰蛋白胨 12.0，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31，甘油5.0。

1.2 儀器與試劑

ZQZY-CQ恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；2WAJ阿貝折光儀，日本AGATO有限公司；7670570真空冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；UnivealTA質(zhì)構(gòu)儀，上海騰拔儀器科技有限公司。

面包用品，安琪酵母有限公司，其他物品均購于國藥集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶液的準(zhǔn)備

搖瓶種子液：將本實(shí)驗(yàn)室保存菌株Escherichiacoli/pET-24a-cybe，E.coli/pET-24a-gtf5和E.coli/pET-24a-gtf13按照2‰ (體積分?jǐn)?shù))的接種量接入10 mL LB培養(yǎng)基中(含30 mg/L卡那霉素)，恒溫培養(yǎng)(37 ℃、200 r/min) 12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將上步種子液按照5% (體積分?jǐn)?shù))的接種率接入TB培養(yǎng)基中(含30 mg/L卡那霉素)，先恒溫培養(yǎng)(37 ℃、200 r/min) 2 h，再更換溫度為25 ℃ 培養(yǎng)24 h。

粗酶液獲得：將發(fā)酵液于4 ℃下離心(8 000 r/min)15 min，收集菌體，收集到的菌體用Na2HPO4-NaH2PO4(50 mmol/L，pH 7.0)緩沖液復(fù)溶，再進(jìn)行高壓勻漿破壁(90 MPa)，結(jié)束后于4 ℃離心(8 000 r/min) 15 min收集上清液，即得粗酶液。

1.3.2 改性麥芽糊精的制備

雙酶復(fù)配處理：稱取一定量的DE6～8麥芽糊精用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液溶解，在加熱磁力攪拌器(90 ℃)下加熱糊化30 min，冷卻至室溫后加入緩沖液定容，使麥芽糊精終質(zhì)量濃度為150 g/L，然后在30 ℃水浴搖床中溫育10 min，加入CyBE反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后加熱煮沸滅酶終止反應(yīng)，冷卻至30 ℃，再加入GTF5/GTF13反應(yīng)24 h，煮沸滅酶?；蛘咴谏鲜鱿嗤磻?yīng)條件下，先加入GTF5/GTF13 反應(yīng)24 h，再加入CyBE反應(yīng)24 h。

單酶處理：按照上述方法制備終質(zhì)量濃度為150 g/L的麥芽糊精底物，然后在30 ℃水浴搖床溫育10 min，加入CyBE或GTF5/13反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后加熱煮沸滅酶終止反應(yīng)。

酶轉(zhuǎn)化液：終反應(yīng)液冷卻至室溫后，12 000 r/min離心15 min，取上清液，冷凍干燥用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 改性麥芽糊精的可溶性固形物含量測定

取1.2.2冷凍干燥的粉末，分析方法為折光計(jì)法，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》。

1.3.4 面包的制作

面包制作配料：普通小麥高筋面粉190 g，水60 g，糖20 g，鹽2 g，奶粉4 g，雞蛋2個(gè)，酵母4 g，黃油10 g。將以上原料攪拌成團(tuán)并將面團(tuán)揉至手套膜狀態(tài)。均勻分割每個(gè)面團(tuán)為60 g，然后在烤箱(38 ℃，相對濕度85%)中醒發(fā)60 min，1次醒發(fā)結(jié)束后整型，按照上述條件再發(fā)酵60 min，發(fā)酵結(jié)束后烘烤15 min(上火190 ℃，下火200 ℃)。添加改性麥芽糊精或改良劑時(shí)，需將其充分溶解于水中再用于面包制作。

1.3.5 面包質(zhì)構(gòu)的測定

面包樣品準(zhǔn)備：將烘烤后的面包切成15 mm的均勻薄片。

面包質(zhì)構(gòu)參數(shù)檢測：使用質(zhì)構(gòu)儀對面包質(zhì)地進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果為3次重復(fù)的平均值。質(zhì)構(gòu)儀檢測探頭為P/36；測試前速率，測試速率，測試后速率均為1.3 mm/s，測試距離5 mm，兩次壓縮間隔時(shí)間5 s，觸發(fā)力5 g[11]。

1.3.6 面包抗氧化能力的測定

1.3.6.1 面包多酚提取液的制備

將新鮮的面包芯置于真空冷凍干燥機(jī)中，凍干后研磨粉碎。稱取4 g研磨好的面包粉末，向其中加入50 mL 80% (體積分?jǐn)?shù))甲醇，避光提取2 h，期間使用磁力攪拌器攪拌混勻，結(jié)束后于5 000 r/min離心10 min，保存上清液。剩余殘?jiān)貜?fù)上述提取步驟?；旌?次提取的上清液，并于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.6.2 總多酚含量測定

Folin-Ciocalteau法[12]測定總多酚含量步驟如下：準(zhǔn)確移取2 mL的面包多酚提取液，向其中加入1倍體積的福林酚試劑和3倍體積的H2O，混勻，室溫靜置3 min。結(jié)束后加入5倍體積的10% (體積分?jǐn)?shù)) Na2CO3溶液，充分混合均勻，室溫靜置30 min，整個(gè)提取過程需避光。提取結(jié)束后于5 000 r/min離心 5 min，取上清液進(jìn)行吸光值測定(725 nm)。以沒食子酸當(dāng)量表示(mg沒食子酸/g面包粉末)表示總多酚含量。

1.3.6.3 自由基清除能力的測定

2 結(jié)果與分析

研究表明，面包老化與糊精的分支度及支鏈長度之間存在密切關(guān)系。其中，較短支鏈能有效提高糊精的持水能力，DP6～9的支鏈延緩老化的效果較為明顯[15-16]。因此理論上制得分支度高且密集，同時(shí)分支鏈長較短的改性麥芽糊精能有效延緩面包老化。

本研究選用了分支酶CyBE和2種4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF5/GTF13)進(jìn)行復(fù)配。CyBE在催化反應(yīng)時(shí)，主要轉(zhuǎn)移DP6～10的麥芽寡糖在糊精直鏈上形成支鏈，同時(shí)GTF5/GTF13能夠在新形成支鏈的非還原端，通過連續(xù)的α-1,6-糖苷鍵連接形成異麥芽寡糖結(jié)構(gòu)。因此以CyBE和GTF5/GTF13復(fù)配理論上能制備具備上述結(jié)構(gòu)特性的改性麥芽糊精產(chǎn)物。

2.1 改性麥芽糊精溶解度分析

麥芽糊精在食品添加劑中應(yīng)用廣泛，因此良好的溶解性和貯藏穩(wěn)定性十分重要[17]。酶改性后的麥芽糊精其理化性質(zhì)也會發(fā)生變化，使用阿貝折光儀測定麥芽糊精改性前后溶解度的變化。結(jié)果顯示(表1)，未經(jīng)酶作用的麥芽糊精底物雖溶解性較好(70.19%)，但在室溫放置24 h后會發(fā)生老化沉降。單酶CyBE、GTF5和GTF13改性后的產(chǎn)物溶解度變差，分別為63.26%、45.87%和43.56%，且存在老化渾濁的現(xiàn)象。經(jīng)雙酶復(fù)配得到的4種產(chǎn)物均有較好溶解度，其中CyBE-GTF13組的產(chǎn)物溶解度最高，可達(dá)63.17%。且雙酶復(fù)配產(chǎn)物均具有良好的貯藏穩(wěn)定性，室溫放置7 d后仍呈澄清透明狀態(tài)，流動性較好。

表1 改性麥芽糊精的溶解度分析Table 1 Analysis of solubility of modified maltodextrin

2.2 添加改性麥芽糊精對面包質(zhì)構(gòu)參數(shù)的影響

質(zhì)構(gòu)儀通過模擬人口腔的咀嚼過程來確定受測面包的硬度、黏度和彈性等參數(shù)[18]，這些參數(shù)能直觀地展現(xiàn)烘焙面包的品質(zhì)。其中硬度是面包最重要的質(zhì)構(gòu)特性，一般消費(fèi)者更青睞于質(zhì)地柔軟的面包。

本文研究了不同面包改良劑的添加對面包硬度的影響，實(shí)驗(yàn)中添加量均為5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) (此添加量參照市售改良劑的建議使用量)，其中不添加改性麥芽糊精的為空白對照組，添加改性麥芽糊精的為實(shí)驗(yàn)組。面包質(zhì)構(gòu)結(jié)果如表2所示。改良劑的種類包括本研究制備的改性麥芽糊精、市售糊精類產(chǎn)品(抗性糊精和焦糊精)及市售安琪酵母改良劑。面包質(zhì)構(gòu)結(jié)果顯示，添加了CyBE-GTF13改性麥芽糊精的實(shí)驗(yàn)組對面包硬度改良效果最佳，僅為空白對照組的28.98%，且優(yōu)于市售糊精類產(chǎn)品和安琪酵母改良劑。

表2 面包硬度結(jié)果Table 2 Bread hardness results

2.3 改性麥芽糊精的添加量優(yōu)化結(jié)果分析

為進(jìn)一步研究改性麥芽糊精添加量對面包硬度的影響，我們選取了硬度降低相對較大的CyBE-GTF13實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行此項(xiàng)研究。結(jié)果如表3所示，隨著添加量的增大，面包芯的硬度會出現(xiàn)先降低再上升的趨勢。當(dāng)改性麥芽糊精添加量在3%～10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，對面包硬度的改善效果會隨著添加量的增大而變強(qiáng)。而當(dāng)改性麥芽糊精的添加量>10%時(shí)，此時(shí)對面包硬度的改善效果會降低。但在實(shí)際使用過程中，當(dāng)添加量為10%時(shí)，會引起面粉黏度過大、導(dǎo)致不易起筋、使用感較差等問題。因此，選擇5%作為改性麥芽糊精的添加量以進(jìn)行后續(xù)研究。

表3 改性麥芽糊精添加量對面包硬度的影響Table 3 The results of different modified maltodextrin additions on hardness

2.4 改性麥芽糊精對延緩烘焙面包老化的影響

根據(jù)前期篩選優(yōu)化結(jié)果，將CyBE-GTF13改性麥芽糊精產(chǎn)物以5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加量用于面包制作，TPA質(zhì)構(gòu)儀測定面包硬度。結(jié)果顯示，添加CyBE-GTF13實(shí)驗(yàn)組第1天的硬度降至640.15 g，僅為對照組硬度(2 208.53 g)的28.99%。同時(shí)，將面包在4 ℃貯藏21 d后，對照組的硬度值為4 257.57 g，而添加了改性麥芽糊精的實(shí)驗(yàn)組面包硬度為1 254.48 g，為對照組硬度的29.46%。

2.5 改性麥芽糊精對面包抗氧化性能的影響

抗氧化能力是指能夠清除自由基的能力，多酚物質(zhì)的存在能夠提高抗氧化能力，從而預(yù)防因自由基存在而引起的例如糖尿病，心血管疾病和老年癡呆等疾病[19]。面粉中存在能夠抵抗氧化的多酚類物質(zhì)，然而游離的多酚類物質(zhì)會在面團(tuán)烘烤過程中因高溫而損失[20]。

為研究添加改性糊精對多酚類物質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)對多酚類物質(zhì)總含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，添加了CyBE-GTF13改性麥芽糊精的實(shí)驗(yàn)組總多酚含量為1.63 mg/g，為空白對照組(0.91 mg/g)的1.79倍。同時(shí)，面包的抗氧化能力以DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除率來表示，結(jié)果顯示(表4)，添加了CyBE-GTF13改性麥芽糊精的實(shí)驗(yàn)組對以上3種自由基的清除率較對照組分別提升了2、8、4倍，表明改性麥芽糊的添加對面包抗氧化能力有顯著提升作用。分析其原因，改性麥芽糊精因具有分支度高且密集、分支鏈長較短的特點(diǎn)，相對于具有長直鏈結(jié)構(gòu)的淀粉，不容易發(fā)生聚集老化，因此暴露更多游離的羥基與多羥基的多酚類物質(zhì)通過氫鍵作用相互結(jié)合[20]，使得游離的多酚類物質(zhì)相對減少，因此在烘焙過程中總的多酚類物質(zhì)的損失降低，從而抗氧化性能提高。

表4 面包抗氧化能力數(shù)據(jù)Table 4 Bread antioxidant capacity data

3 結(jié)論

本研究以麥芽糊精為底物，利用分支酶(CyBE)和4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF5/GTF13)復(fù)配反應(yīng)制備改性麥芽糊精，研究了不同酶處理(加酶順序/4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇)所制備的改性麥芽糊精產(chǎn)物，在改善面包質(zhì)地方面的應(yīng)用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4種改性麥芽糊精產(chǎn)物的添加均能夠顯著改善面包硬度，其中CyBE-GTF13改性麥芽糊精實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)最佳。進(jìn)一步優(yōu)化了面包制作中改性麥芽糊精的添加量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加量為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，面包硬度值可由對照組的2 208.53 g降至640.15 g，僅為對照組的28.99%，在4 ℃貯藏21 d后，對照組的硬度值為4 257.57 g，而添加了改性麥芽糊精的實(shí)驗(yàn)組面包硬度為1 254.48 g，為對照組硬度的29.46%；同時(shí)，添加該種改性麥芽糊精的面包對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除率，較對照組分別提升了2、8、4倍。以上結(jié)果表明，改性麥芽糊精在改善面包硬度，延緩面包老化，提高面包抗氧化能力具有積極作用，該改性麥芽糊精的制備方法為未來食品加工生產(chǎn)領(lǐng)域提供了一定的參考意見與價(jià)值。但目前此項(xiàng)研究僅限于實(shí)驗(yàn)室水平，未來可進(jìn)一步探究目標(biāo)酶在食品安全菌株中的發(fā)酵潛力，為規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。