潘虹江，王煥昇，裴發(fā)軍，楊明山

1山東第一醫(yī)科大學山東省醫(yī)學科學院研究生部，濟南250000；2山東第一醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院山東省腫瘤醫(yī)院泌尿外科

腎透明細胞癌（CCRCC）是常見的腎癌類型，早期可通過根治手術(shù)獲得治愈，晚期對放化療均不敏感，患者預后不佳［1］。隨著靶向制劑和免疫療法的引入，晚期CCRCC短期客觀緩解率有所提高，但是長期緩解率仍然較低。早期診斷和準確預后評估在CCRCC臨床診治中具有重要意義。免疫相關(guān)基因是CCRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，免疫治療已成為改善CCRCC臨床結(jié)局的主要方法［2］。程序性細胞死亡受體1（PD-1）是適應性和先天免疫應答的抑制劑，在腫瘤浸潤淋巴細胞中表達，與腫瘤細胞表面的程序性死亡受體配體1（PD-L1）結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控T細胞活性，誘導腫瘤反應性細胞毒性T細胞功能衰竭，抗腫瘤T細胞免疫，參與腫瘤細胞的免疫逃避［3-4］。PD-1異常表達與乳腺癌［5］、結(jié)腸直腸癌［6］、胃癌［7］預后不良有關(guān)，但目前關(guān)于PD-1在腎癌預后方面的研究較少，在腎癌的病理性發(fā)展過程中，PD-1對其調(diào)控性作用以及預后的評估中價值尚存在較大的爭議性，有待進一步研究過程。近十幾年來，部分專家學者認為通過免疫療法用于腎癌的臨床治療效果并不理想。但隨著人們對PD-1認識的增加，可以為人類腫瘤相關(guān)疾病的有效免疫治療帶來了新的契機。本研究觀察了CCRCC組織中PD-1的表達變化，并分析患者不良預后的危險因素，旨在為CCRCC臨床診治、預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月—2018年1月收治的CCRCC患者67例，男40例，女27例；年齡51～72（63.57±6.59）歲，其中<60歲29例、≥60歲38例；腫瘤直徑：<4 cm 21例，4～7 cm 19例，8～10 cm 15例，>10 cm 12例；Fuhrman分級：Ⅰ～Ⅱ級28例，Ⅲ～Ⅳ級39例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期42例；腫瘤壞死21例，無腫瘤壞死46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；遠處轉(zhuǎn)移13例，無遠處轉(zhuǎn)移54例。納入標準：①經(jīng)術(shù)后病理組織學確診為CCRCC；②年齡>20歲，病理資料完整；③溝通無障礙，無精神疾病史；④患者或其家屬知情同意；⑤入院之前未接受過放化療治療。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②腎炎、腎結(jié)石、腎囊腫等其他腎臟疾??；③隨訪失聯(lián)者。手術(shù)留取CCRCC組織和癌旁組織（距離癌組織1 cm以上，經(jīng)病理證實無癌細胞浸潤）各67例份。本研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 腎組織PD-1檢測方法 取癌組織及癌旁組織標本各0.2 g，經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，用RM2255全自動輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica）制作4μm切片。二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水洗滌，108℃高壓2 min，PBS沖洗3次。3%過氧化氫/甲醇溶液室溫下阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，PBS沖洗3次。1%稀釋正常馬血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃下孵育30 min，阻斷非特異性抗體結(jié)合，PBS沖洗后加入PD-1抗體（均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃靜置1 h。PBS沖洗3次加二抗，37℃靜置1 h，PBS沖洗3次，加入鏈霉素抗生物素—過氧化物酶顯色3～5 min，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色3～5 min。自來水沖洗，再經(jīng)蘇木素復染、乙醇梯度脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡隨機選取5個高倍視野進行觀察，以PBS代替一抗為陰性對照。隨機選擇癌組織及癌旁組織各3個切片，每個切片隨機選取5個高倍視野，由2個病理科醫(yī)師采用半定量法進行評定，將細胞質(zhì)或細胞核中的淡黃色至棕褐色顆粒定義為陽性。染色密度評分標準：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比評分標準：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色密度評分與陽性細胞百分比評分相乘的積為免疫反應評分（IRS），IRS評分≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.3 CCRCC患者隨訪方法 所有患者術(shù)后定期電話隨訪，隨訪截止時間為2020年6月，最長隨訪時間36個月，中位隨訪時間為20（16～32）個月。記錄隨訪期間患者腫瘤復發(fā)、患者死亡情況，無進展生存期（PFS）定義為自接受手術(shù)日期至觀察到疾病進展或因隨訪截止的時間，總生存期（OS）定義為接受手術(shù)日期至因任何原因引起的死亡或因隨訪截止的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存率比較Log-rank檢驗；多因素Cox風險比例回歸結(jié)合逐步后退法分析CCRCC患者預后的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCRCC、癌旁組織中PD-1陽性率比較 CCRCC、癌旁組織中PD-1陽性率分別為38.81%（26/67）、22.39%（15/67），兩者比較，P<0.05。PD-1在各腎組織中的DAB染色圖像見圖1。

圖1 PD-1在各腎組織中的DAB染色圖像

2.2 PD-1陽性表達與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PD-1陽性表達與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可知，PD-1陽性表達與CCRCC Fuhrman分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P均<0.05）。

表1 PD-1陽性表達與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PD-1陽性表達與CCRCC患者預后的關(guān)系 PD-1陽性表達者（26例）、PD-1陰性表達者（41例）PFS生存率分別為42.31%（11/26）、85.37%（35/41），OS生存率分別為53.86%（14/26）、87.80%（36/41），兩者比較，P均<0.05。

2.4 CCRCC患者預后不良影響因素、危險因素分析結(jié)果 67例CCRCC患者均獲得隨訪，隨訪最長時間3 a，隨訪期間復發(fā)21例、無復發(fā)46例，生存50例、死亡17例。以CCRCC患者隨訪期間預后生存情況為因變量（1=死亡，0=存活，t=生存期），納入年齡（賦值：連續(xù)性變量）、性別（賦值：1=男，2=女）、腫瘤直徑（賦值：1=≥8 cm，0=<7 cm）、Fuhrman分級（賦值：1=Ⅲ～Ⅳ級，0=Ⅰ～Ⅱ級）、TNM分期（賦值：1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期）、腫瘤壞死（賦值：1=有，0=無）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（賦值：1=有，0=無）、遠處轉(zhuǎn)移（賦值：1=有，0=無）、PD-1（賦值：1=陽性，0=陰性）為自變量。單因素Cox風險比例回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)uhrman分級Ⅲ～Ⅳ級、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、PD-1陽性表達與CCRCC患者不良預后發(fā)生有關(guān)（P均<0.05），詳見表2。多因素Cox風險比例回歸分析（逐步后退法，α保留=0.05，α退出=0.10）顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、PD-1陽性表達是CCRCC患者不良預后的危險因素（P均<0.05），見表3。

表2 CCRCC患者預后單因素Cox回歸分析結(jié)果

表3 CCRCC患者預后多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

CCRCC是泌尿系統(tǒng)致命的惡性腫瘤之一，占腎癌的70%～80%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，約1/3的患者在確診時出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，雖然近年治療方法有所改善，但是復發(fā)率、病死率仍然很高，尤其是晚期以及轉(zhuǎn)移性患者預后較差［8-9］。腫瘤免疫是腫瘤細胞躲避機體免疫系統(tǒng)攻擊，導致腫瘤進展、侵襲及轉(zhuǎn)移的主要機制之一，免疫抑制通路相關(guān)蛋白與腫瘤免疫細胞失能、凋亡有關(guān)［10-11］。研究［12-13］顯示，逆轉(zhuǎn)抗腫瘤免疫細胞衰竭和重新激活免疫反應已成為改善CCRCC患者生存結(jié)局的重要手段。因此，識別與CCRCC腫瘤免疫抑制密切相關(guān)的生物標志物，對CCRCC病情進展和預后分析具有十分重要的意義。

PD-1屬于免疫球蛋白CD28/B7超家族成員，是一種具有負向免疫調(diào)節(jié)功能的跨膜糖蛋白，由288個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于PDCD1基因上，結(jié)構(gòu)主要包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）樣結(jié)構(gòu)域、疏水的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)包括C端和N端氨基酸殘基，含有2個獨立的磷酸化作用位點，分別為免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。PD-1在T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、單核細胞及樹突狀細胞中廣泛表達，在腫瘤特異性T細胞上高表達，通過與PD-L1結(jié)合調(diào)節(jié)T細胞活性，激活抗原特異性T細胞凋亡和抑制調(diào)節(jié)性T細胞凋亡，在抑制免疫應答和促進自身耐受性方面發(fā)揮重要作用［14-16］。T細胞表面PD-1與PD-L1結(jié)合后，PD-1胞內(nèi)段C端免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序發(fā)生磷酸化而被激活，磷酸化的C端免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序募集胞內(nèi)Src同源區(qū)2含域磷酸酶-2（SHP-2）分子，SHP-2可抑制Toll樣受體去磷酸化，同時抑制T淋巴細胞增殖分化，損傷T細胞效能，使T淋巴細胞功能“耗竭”，降低對腫瘤殺傷能力。有研究［17］發(fā)現(xiàn)，抑制PD-1和PD-L1可增強T細胞應答，介導抗腫瘤活性。臨床試驗表明，PD-1/PD-L1信號阻斷劑對多種實體惡性腫瘤或血液腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用［18-19］。

PD-1參與多種惡性腫瘤發(fā)生和進展。乳腺癌組織中PD-1表達升高，其表達與癌患者不良預后相關(guān)［20］。PD-1在結(jié)直腸癌表達升高，是患者整體生存和無進展生存的獨立預測因素［21］。PD-1、PD-L1在前列腺癌組織中表達上調(diào)，PD-1/PD-L1表達與三螺旋重復膠原蛋白Ⅰ過表達及腫瘤進展有關(guān)［22］。PD-1在腎癌原發(fā)病灶以及轉(zhuǎn)移病灶中均呈高表達，在肺/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶中陽性率為65.3%，在腦、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移病灶陽性率分別為10.5%、12.5%，PD-1表達與原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腎癌患者總生存期較短有關(guān)［23］。本研究顯示，CCRCC組織中PD-1陽性率明顯高于癌旁組織，PD-1表達與Fuhrman分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明PD-1參與CCRCC發(fā)生和進展。PD-1通過抑制三磷酸肌醇激酶激活、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，抑制S期激酶相關(guān)蛋白2轉(zhuǎn)錄阻止細胞周期進入G期，抑制T淋巴細胞增殖，進而導致腫瘤微環(huán)境改變，免疫逃逸和侵襲轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1陽性表達者OS和PFS生存率均低于PD-1陰性表達者，PD-1陽性表達是CCRCC患者預后不良的危險因素之一，說明PD-1陽性表達與CCRCC患者預后不良有關(guān)。PD-1/PD-L1軸通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路促使CD8+T細胞凋亡，還可通過促進調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）發(fā)育和抑制輔助性T細胞17（Th17），導致Th17/Treg向Treg傾斜，Treg細胞過度產(chǎn)生抑制Th17細胞分化和抗腫瘤活性，促使腫瘤進展［24］。PD-1/PD-L1可誘導蛋白激酶B與細胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化，激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路增加癌細胞耐藥基因表達，促使化療耐藥，導致術(shù)后復發(fā)和不良結(jié)局發(fā)生。本文結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移也與CCRCC患者不良預后存在密切關(guān)系，提示癌細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移均可導致癌癥擴散，增加臨床治療難度，使患者發(fā)生復發(fā)和死亡的風險加大。

總之，CCRCC癌組織PD-1表達升高，其陽性表達與CCRCC惡性生物學行為有關(guān)，是患者預后不良的危險因素，PD-1有望成為CCRCC預后評估潛在生物學指標。