醉茄素A通過(guò)調(diào)節(jié)自噬緩解心肌細(xì)胞缺血/再灌注（缺氧/復(fù)氧）損傷*

郭 蕊， 宋慧芳， 康 毅

（山西醫(yī)科大學(xué)1形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2人體解剖學(xué)教研室，山西太原030001；3山西省腫瘤醫(yī)院消化二科，山西太原030013）

最新版中國(guó)心血管病報(bào)告指出中國(guó)心血管病現(xiàn)患人數(shù)已達(dá)3.3億，目前死亡率居首位高于腫瘤和其他疾?。?］。心肌梗死（myocardial infarction）在心血管疾病中是致死率較高的疾病，迅速解除梗阻恢復(fù)血液灌流是降低心梗損傷的有效策略，但研究發(fā)現(xiàn)血液復(fù)灌常常伴隨心肌組織進(jìn)一步損傷［2-3］。尋找有效藥物，降低心肌缺血/再灌注（myocardiac ischemia/reperfusion，MI/R）損傷，在心?；颊咧委熤芯哂兄匾R床意義。

醉茄素A（withaferin A，WFA）是從醉茄中提取的主要有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、抗腫瘤及治療COVID-19等功效［4-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度WFA可降低心肌缺血再灌注損傷［7-8］，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，細(xì)胞自噬在MI/R中的作用受到廣泛研究。最新研究提示，自噬流受阻是造成再灌注損傷的關(guān)鍵［9-10］。本研究觀察自噬在WFA緩解MI/R損傷中的變化，探討自噬在此過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，為闡明WFA心血管保護(hù)機(jī)制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 H9C2細(xì)胞體外培養(yǎng)

H9C2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。按照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞操作流程，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，即為對(duì)照（control）組。缺氧/復(fù)氧（即模擬缺血/再灌注，simulated ischemia/reperfusion，SI/R）組的細(xì)胞用含有酚紅的Hanks液，置于低氧（1%O2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，更換成正常培養(yǎng)液，在普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。WFA治療（WFA+SI/R）組在SI/R處理前30 min用WFA（終濃度為150 nmol/L）處理細(xì)胞。氯喹（chloroquine，CQ）預(yù)處理（CQ+WFA+SI/R）組在SI/R處理前1 h用CQ（終濃度為10μmol/L）處理細(xì)胞。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡雄性C57BL/6小鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（晉）2015-0001。小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、MI/R組、WFA治療（WFA+MI/R）組和CQ預(yù)處理（CQ+WFA+MI/R）組。

2.2 MI/R模型的制備及給藥 將小鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎，缺血30 min后打開(kāi)結(jié)扎線，再灌注3或12 h（分離再灌注3 h小鼠心臟組織，用于TUNEL染色，再灌注12 h的小鼠用于超聲成像以檢測(cè)左心室功能），造成MI/R損傷。假手術(shù)組除了只穿線不結(jié)扎外，其余的步驟均與MI/R組相同。WFA治療組于術(shù)前1.5 h腹腔注射1 mg/kg WFA，非治療組注射等體積藥物溶劑。CQ預(yù)處理組手術(shù)前兩天腹腔注射60 mg/kg CQ溶液，連續(xù)注射2 d，非預(yù)處理組注射等體積藥物溶劑。

3 主要方法

3.1 Western blot檢測(cè)蛋白水平 用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，采用Bradford法測(cè)量蛋白濃度。蛋白變性后，恒壓SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）。5%脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，每一步孵育后均使用TBST洗膜15 min×3次。ECL發(fā)光檢測(cè)，用ImageJ軟件測(cè)量圖像灰度值進(jìn)行分析。

3.2 mRFP-GFP-LC3雙熒光染色 12孔板接種H9C2細(xì)胞，細(xì)胞接種量每孔5×104個(gè)。次日細(xì)胞貼壁后，使用Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑（碧云天），按照說(shuō)明轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后，按照分組處理細(xì)胞，熒光顯微鏡拍照。

3.3 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力 96孔板接種H9C2細(xì)胞，細(xì)胞接種量每孔5 000個(gè)，細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（A），根據(jù)A值計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。

3.4 caspase-3活性的檢測(cè) 裂解液按常規(guī)流程裂解細(xì)胞后，按照caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)量樣品中caspase-3活性，另取少量細(xì)胞裂解液測(cè)量蛋白濃度，計(jì)算相同單位質(zhì)量蛋白中所含cas?pase-3的活性單位。

3.5 TUNEL染色 心臟經(jīng)固定、脫水制作石蠟切片，脫蠟處理后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL染色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡采集圖像并分析。

3.6 超聲檢測(cè)左心室功能 經(jīng)1%~2%異氟醚麻醉后，小鼠維持穩(wěn)定麻醉狀態(tài)。將超聲探頭（Vevo 2100，MS-550D）置于小鼠左側(cè)胸前，調(diào)節(jié)探頭位置和角度尋找兩側(cè)乳頭肌短軸平面，M模式下連續(xù)記錄3個(gè)收縮循環(huán)周期的左心室多普勒?qǐng)D像，用于分析左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)由SPSS 23軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，隨后用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 WFA在缺氧/復(fù)氧損傷中對(duì)H9C2細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H9C2細(xì)胞SI/R損傷后LC3-II/LC3-I、beclin-1、p62和溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，Lamp-2）水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）；而與SI/R組相比，WFA治療組LC3-II/LC3-I、beclin-1和p62水平顯著降低（P<0.05），Lamp-2表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy-related protein levels in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfu?sion（SI/R）injury.Mean±SD.n=3.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs SI/Rgroup.圖1 醉茄素A對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞自噬水平的影響

mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示，SI/R組自噬溶酶體紅色熒光增多，WFA治療組與SI/R組相比紅色熒光減少，見(jiàn)圖2。

2 加入CQ后H9C2細(xì)胞自噬指標(biāo)的變化

CQ預(yù)處理并不影響beclin-1、p62和Lamp-2蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平；但與單純SI/R組相比，CQ+SI/R組p62和Lamp-2表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），beclin-1的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）；而與WFA+SI/R組相比，CQ+WFA+SI/R組beclin-1、p62和Lamp-2表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），見(jiàn)圖3。

3 加入CQ后H9C2細(xì)胞活力和凋亡的變化

離體培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CQ預(yù)處理可顯著抑制WFA組對(duì)自噬水平的降低作用，CQ預(yù)處理組LC3-II/LC3-I比值顯著高于WFA治療組（P<0.01），見(jiàn)圖4A；H9C2細(xì)胞活力顯著低于WFA治療組（P<0.01），見(jiàn)圖4B；CQ預(yù)處理組H9C2細(xì)胞cleaved caspase-3的蛋白水平和caspase-3活性顯著高于WFA治療組（P<0.001），見(jiàn)圖4C、D。

4 CQ對(duì)WFA心功能保護(hù)作用的影響

心臟超聲結(jié)果顯示，CQ預(yù)處理組LVEF和LVFS顯著低于WFA治療組（P<0.01），見(jiàn)圖5A；心肌組織TUNEL染色結(jié)果顯示，CQ預(yù)處理組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于WFA治療組（P<0.01），見(jiàn)圖5B。

討 論

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，是心臟疾病中引起患者死亡最常見(jiàn)的病因之一。急性冠脈綜合征的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是最短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)冠脈血液供應(yīng)。盡管缺血區(qū)心肌恢復(fù)血液供應(yīng)可以緩解心肌壞死，但也伴隨著缺血區(qū)域的損傷加重［11］。臨床治療中，尋找有效的方式緩解再灌注損傷是本領(lǐng)域多年來(lái)研究熱點(diǎn)。WFA是醉茄中提取的生物活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有提高免疫力、抗氧化應(yīng)激和抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，WFA在MI/R損傷下可顯著增強(qiáng)左心室收縮和舒張能力，改善心功能。

自噬是真核生物保守的細(xì)胞內(nèi)成分降解-再循環(huán)的過(guò)程，在維持心臟正常代謝、損傷修復(fù)時(shí)起重要作用［12］。盡管自噬在MI/R損傷中的作用仍存在爭(zhēng)議，但最新的研究發(fā)現(xiàn)自噬流的形成或降低異常在MI/R損傷過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［10，13］。自噬主要包括自噬體形成、自噬體與溶酶體融合繼而降解等主要過(guò)程，生理狀態(tài)下自噬處于動(dòng)態(tài)平衡，而病理狀態(tài)下任何環(huán)節(jié)改變均可能打破自噬平衡，引起細(xì)胞和組織器官的功能紊亂［14-15］。本研究結(jié)果顯示，與control組相比，SI/R組LC3-II/LC3-I比值升高，提示自噬水平升高。與SI/R組相比，WFA治療組LC3-II/LC3-I比值和p62表達(dá)降低，而Lamp-2表達(dá)顯著升高，提示W(wǎng)FA有效抑制了SI/R引起的自噬水平升高。CQ是自噬體與溶酶體融合的抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn)，與WFA治療組相比，CQ預(yù)處理組LC3-II/LC3-I比值和p62蛋白表達(dá)水平顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低；在體研究結(jié)果顯示，CQ預(yù)處理組心功能顯著低于WFA治療組。以上結(jié)果提示，WFA主要是通過(guò)促進(jìn)自噬體與溶酶體融合，降低過(guò)高的自噬水平，維持自噬流通暢，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡，改善MI/R損傷后心功能。

Figure 2.The effect of withaferin A（WFA）on LC3 level in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfusion（SI/R）injury（mRFP-GFP-LC3 dual-fluorescence staining，×200）.圖2 醉茄素A對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞LC3水平的影響

Figure 3.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy-related protein levels in the H9C2 cells with simulated ischemia/reperfu?sion（SI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs SI/R group；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+SI/Rgroup.圖3 氯喹預(yù)處理后醉茄素A對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞自噬水平的影響

Figure 4.The effect of withaferin A（WFA）on autophagy（A），viability（B）and apoptosis（Cand D）of the H9C2 cells with simu?lated ischemia/reperfusion（SI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs SI/Rgroup；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+SI/Rgroup.圖4 氯喹預(yù)處理后醉茄素A對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞自噬、活力和凋亡的影響

Figure 5.The effect of withaferin A（WFA）on cardiac function（A）and myocardial apoptosis（B，×100）in the mice with myocar?dial ischemia/reperfusion（MI/R）injury after chloroquine（CQ）pretreatment.Mean±SD.n=7~10.*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle+MI/R group；#P<0.05，##P<0.01 vs WFA+MI/R group.圖5 氯喹預(yù)處理后醉茄素A對(duì)心肌缺血/再灌注損傷小鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，本研究證實(shí)WFA通過(guò)促進(jìn)自噬體與溶酶體融合，保持自噬流通暢，抑制由缺血/再灌注導(dǎo)致的自噬水平升高，進(jìn)而緩解缺血/再灌注引起的心肌組織損傷。這一結(jié)果將為今后臨床治療的新藥研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。