沙門氏菌鑒定和分型方法比對(duì)研究

◎ 李赫婧，王立平，楊紅蓮，薛晨玉，王 丹

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100094）

沙門氏菌是食源性疾病重要的致病菌，我國(guó)每年由沙門氏菌引起的中毒事件屢居首位[1]。依據(jù)現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]，食品中沙門氏菌的鑒定和分型多采用常規(guī)生化鑒定的方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作煩瑣，費(fèi)力、耗時(shí)，無法滿足食品安全突發(fā)事件應(yīng)急檢驗(yàn)的要求[3]。采用合適的鑒定和分型方法，對(duì)致病菌的快速溯源具有重要意義[4-5]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）是近幾年發(fā)展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的生物質(zhì)譜技術(shù)，該方法基于細(xì)菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)組指紋圖譜分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫或者自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可以鑒定至屬、種，乃至亞種的水平，具有快速、準(zhǔn)確、通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于微生物的高通量篩選[6-8]。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型使用血清玻片凝集作為早期沙門氏菌分型方法，該方法直觀可靠，是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的分型方法。但存在耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作經(jīng)驗(yàn)有要求，血清質(zhì)量參差不齊而導(dǎo)致結(jié)果偏差等不足之處。多位點(diǎn)序列分型（MLST）是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，該方法通過對(duì)多個(gè)管家基因內(nèi)部片段進(jìn)行序列測(cè)定，分析菌株的變異，配合使用EnteroBase數(shù)據(jù)庫提供的物種持家基因信息比對(duì)獲得沙門氏菌各菌株的MLST分型，從而為沙門氏菌分型提供更高的分辨力和更明確的分型方法[9-10]。

本文采用生化鑒定和MALDI-TOF-MS對(duì)雞肉中分離的沙門氏菌進(jìn)行種屬鑒定，采用傳統(tǒng)血清學(xué)方法和MLST分子手段進(jìn)行血清型分型，比較不同的技術(shù)手段具有的優(yōu)缺點(diǎn)，剖析其方法機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行沙門氏菌鑒定以及權(quán)衡每種分型技術(shù)的利弊提供參考，使實(shí)驗(yàn)室能更好地根據(jù)菌株特性、分型目的和實(shí)驗(yàn)室擁有的條件選擇合適方法進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

生雞肉樣品，購(gòu)自北京市市場(chǎng)；BPW培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SC培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、SWARM瓊脂等，購(gòu)自北京陸橋培養(yǎng)基公司；沙門顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司；腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒，購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，購(gòu)自丹麥SSI公司；PCR預(yù)混液和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物，由北京生工生物技術(shù)有限公司合成；IVD BTS、IVD HCCA，購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；乙腈、乙醇、三氟乙酸、甲酸和無水乙醇，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Sigma 3K18離心機(jī)、電熱恒溫水浴、Bio-RAD MyCyclerTM PCR儀、Bio-RAD電 泳 儀、Bio-RAD Gel Doc XR凝膠成像分析系統(tǒng)、布魯克基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、Nanodrop分光光度計(jì)。

1.3 沙門氏菌初篩

參照GB 4789.4—2016[2]方法進(jìn)行生雞肉中沙門氏菌的初篩。無菌操作稱取25 g樣品，置于盛有225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)1 min左右，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。各移取1 mL增菌液轉(zhuǎn)接種于10 mL TTB和10 mL SC內(nèi)，分別于42 ℃和36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取TTB及SC培養(yǎng)液各1環(huán)，分別接種于一個(gè)BS瓊脂平板、一個(gè)XLD瓊脂平板和一個(gè)沙門氏菌顯色平板，于36 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、24 h和24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 生化鑒定

挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌使用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定，參照其說明書進(jìn)行操作，將各反應(yīng)管結(jié)果記錄于報(bào)告單上。計(jì)算數(shù)據(jù)得到7位數(shù)字編碼，通過APILAB PLUS鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。

1.5 質(zhì)譜鑒定

使用MALDI-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌涂抹在樣品靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫干燥，再滴加1 μL HCCA基質(zhì)溶液，室溫干燥，將靶板放入儀器內(nèi)，設(shè)定檢測(cè)參數(shù)，進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.6 MLST分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行沙門氏菌基因組提取，核酸質(zhì)量使用Nanodrop分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。選取沙門氏菌7個(gè)管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA進(jìn)行MLST分型，7個(gè)基因的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物參照SN/T 4525.1—2016合成[11]。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：PCR預(yù)混液（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）和下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模 板1 μL，超 純 水7 μL。PCR反 應(yīng) 條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min，最后4 ℃保存。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行MLST分型。

1.7 血清分型

挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落，以生理鹽水作為對(duì)照，參照GB 4789.4—2016[2]的方法進(jìn)行O抗原和H抗原的血清分型。依次用O因子多價(jià)血清做凝集實(shí)驗(yàn)，判定O群，再進(jìn)行O復(fù)合因子血清或單因子血清的核對(duì)。確定O價(jià)抗原因子后，根據(jù)H抗原表所述H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化鑒定結(jié)果

經(jīng)過選擇性平板分離初篩，31個(gè)生雞肉樣品中共篩出15株可疑沙門氏菌，對(duì)其進(jìn)行API生化鑒定，結(jié)果顯示其中11株為沙門氏菌屬，生化型分為6704552和6704752兩種，具體生化鑒定結(jié)果詳見表1。

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)15株可疑沙門氏菌進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入儀器中自帶微生物指紋圖譜庫進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)運(yùn)算后得到鑒定結(jié)果，查看鑒定分值，其中11株菌鑒定為沙門氏菌屬，具體質(zhì)譜鑒定結(jié)果詳見表1。

表1 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果表

2.3 MLST分型結(jié)果

將MLST測(cè)序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫（http：//mlst.war-wick.ac.uk/mlst）進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析，11株菌共包含5個(gè)ST型，其中ST19型（5株）、ST34型（1株）和ST29型（1株）預(yù)測(cè)為鼠傷寒沙門菌，ST11型（3株）預(yù)測(cè)為腸炎沙門氏菌，ST1628型1株（EnteroBase數(shù)據(jù)庫中未對(duì)該ST型進(jìn)行血清型預(yù)測(cè)）。MLST具體分型及預(yù)測(cè)血清型結(jié)果詳見表2。

表2 MLST和血清分型結(jié)果表

2.4 血清分型結(jié)果

使用丹麥SSI血清對(duì)11株沙門氏菌進(jìn)行血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn)，共檢出3種血清型，分別為3株腸炎沙門氏菌、7株鼠傷寒沙門氏菌和1株里定沙門菌，具體血清學(xué)分型結(jié)果詳見表2。

2.5 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較與分析

本次對(duì)15株可疑沙門氏菌進(jìn)行API生化鑒定和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示兩種方法對(duì)15株菌的鑒定結(jié)果均一致。生化鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定均能較準(zhǔn)確的鑒定到沙門氏菌屬或種的水平，但是兩者的檢測(cè)用時(shí)和檢測(cè)成本不同。相比較傳統(tǒng)生化鑒定方法，質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn)，一次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，可作為沙門氏菌高通量初篩的方法，經(jīng)初篩為陽性的目標(biāo)菌再通過生化鑒定等金標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行確證，這樣會(huì)大大提高目標(biāo)菌的發(fā)現(xiàn)率。

2.6 血清和MLST分型結(jié)果比較與分析

本次對(duì)11株沙門氏菌分別用血清和MLST進(jìn)行分型，結(jié)果顯示沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性，其中10株菌MLST的預(yù)測(cè)結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致，ST11對(duì)應(yīng)腸炎沙門氏菌，ST19、ST34和ST29對(duì)應(yīng)鼠傷寒沙門氏菌，僅有一株菌（樣品號(hào)LHJ-7）MLST分型為ST1628，EnteroBase數(shù)據(jù)庫顯示沒有對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)血清型，其血清學(xué)分型結(jié)果為里定沙門氏菌，可能由于該菌株在某一MLST基因位點(diǎn)上有突變導(dǎo)致與血清學(xué)結(jié)果偏差。以血清分型方法為參照方法，本次實(shí)驗(yàn)MLST對(duì)沙門氏菌分型的準(zhǔn)確度為90.9%（10/11）。

血清學(xué)與MLST在沙門氏菌分型上均表現(xiàn)出較好的鑒定能力，但血清分型操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作經(jīng)驗(yàn)有一定要求，其檢測(cè)結(jié)果受制于試劑質(zhì)量，目前各廠商血清質(zhì)量參差不齊，部分菌株由于變異存在無法分型或交叉凝集等錯(cuò)誤結(jié)果。相比較于血清學(xué)分型，MLST分型具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)驗(yàn)用時(shí)短、結(jié)果更加精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)。如將MLST與血清分型聯(lián)合使用，先通過MLST對(duì)菌進(jìn)行血清型預(yù)測(cè)，再有針對(duì)性的進(jìn)行血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn)，將會(huì)極大提高血清分型的效率，尤其對(duì)于一些不常見的血清型，往往需要全套的診斷血清進(jìn)行分型，如果有血清預(yù)測(cè)結(jié)果，也會(huì)降低對(duì)血清試劑的依賴，降低實(shí)驗(yàn)成本。

3 結(jié)論

文章對(duì)生雞肉樣品進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定與分型，共分離出疑似沙門氏菌15株，同時(shí)采用API生化及質(zhì)譜兩種方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行鑒定，共鑒定出11株沙門氏菌，結(jié)果顯示生化與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。分別采用血清學(xué)和MLST兩種方法對(duì)11株沙門氏菌進(jìn)行分型，結(jié)果顯示MLST共測(cè)出5種ST型，血清分型為3種。通過結(jié)果比較得出沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性，其中10株菌MLST的預(yù)測(cè)結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致。

質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn)，文章僅使用儀器自帶數(shù)據(jù)庫對(duì)沙門氏菌進(jìn)行屬水平的鑒定，如果通過自建數(shù)據(jù)庫，可以對(duì)沙門氏菌進(jìn)行種和亞種水平的鑒定，同時(shí)還具有良好的分型能力，可以作為沙門氏菌快速鑒定的一種補(bǔ)充方法。MLST操作簡(jiǎn)單，能快速得到結(jié)果并且便于不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果之間的比較，已經(jīng)用于多種細(xì)菌的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和進(jìn)化研究。隨著測(cè)序速度的加快、成本的降低以及分析軟件的發(fā)展，MLST有望成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法。