亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性在產(chǎn)前篩查前的性能驗證

張艷秋

【關鍵詞】 亞甲基四氫葉酸還原酶基因;產(chǎn)前篩查;PCR+ 金標免疫層析法;性能驗證

隨著二胎政策放開，高齡孕婦與日俱增，這不僅僅要求醫(yī)師提高剖宮產(chǎn)的手術技能，減少孕產(chǎn)婦死亡率，更為檢驗科工作人員和臨床醫(yī)師敲響警鐘，如何聯(lián)合協(xié)作做好產(chǎn)前篩查，降低新生兒畸形和死亡率。出生缺陷影響著新生兒的生存和后續(xù)生活，也對新生兒家庭產(chǎn)生難以抹去的陰影，更給社會造成了巨大的負擔。現(xiàn)今，新生兒缺陷難以有效治療，所以臨床上多采取產(chǎn)前篩查的方法預防新生兒缺陷發(fā)生。大量研究已經(jīng)證明，亞甲基四氫葉酸還原酶（RecombinantMethylenetetrahydrofolate Reductase， MTHFR） 基因是葉酸代謝通路中的關鍵代謝酶，亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷可以導致5- 甲基四氫葉酸合成減少，通過體內(nèi)生化變化最終導致葉酸水平降低和發(fā)生高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，Hhcy）。同型半胱氨酸會影響破壞血管內(nèi)皮，Hhcy 患者的凝血與纖溶系統(tǒng)常因平滑肌細胞受到血管內(nèi)皮損傷的刺激而破壞，因此導致患者處于血栓前狀態(tài)。同型半胱氨酸也是許多疾病的獨立危險因素，主要在表現(xiàn)在婦幼保健篩查（ 如神經(jīng)管缺陷、先天性心臟病、唇腭裂、妊高癥等）、腫瘤（ 乳腺癌、胃癌、肝癌、兒童急性白血病等）、心腦血管疾病三大主要方面。我們把工作的焦點放在婦幼保健，分析產(chǎn)檢孕婦的亞甲基四氫葉酸還原酶基因變異情況，同期結合遺傳、環(huán)境等多方面因素建立起本地區(qū)有關MTHFR 基因多態(tài)性與產(chǎn)前篩查相關性分析。這個檢測項目對于可能出現(xiàn)的高同型半胱氨酸和葉酸的異常代謝和缺乏給予適當?shù)念A防、適量的補充，有助于指導孕婦服用葉酸，降低唐氏綜合癥、唇腭裂、神經(jīng)管缺陷等新生兒缺陷;做到早發(fā)現(xiàn)、早預防[1]。近些年來，亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR C677T） 多態(tài)性應用于產(chǎn)前篩查已初步通過驗證，但依據(jù)《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》（ISO15189：2012， IDT）[2] 和《醫(yī)療機構實驗室管理辦法》的相關規(guī)定，在開展該項目前，必須行方法學驗證，以確保檢測結果的可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 MTHFR C677T 基因檢測樣本來自2017 年期間門診進行產(chǎn)前篩查的孕婦。樣本為EDTA 抗凝劑的靜脈全血，EDTA 抗凝劑的全血樣本所抽提的DNA 樣本（DNA 的濃度不低于5 ng/?L）A260/A280 應在1.6～2.0 之間。

1.2 方法 1.2.1 樣本DNA 的制備 按照全血基因組DNA 提取試劑盒使用說明書分離全血中的基因組DNA。

1.2.2 PCR 擴增液準備 ①取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，以便于為每份樣本分別進行兩種反應。②從-20℃的環(huán)境中將試劑取出并置于外界環(huán)境中升至室溫，瞬時離心。分別將29?L 擴增液（M）、擴增液（WT） 加入標記有M 和WT 的薄壁管中。③準確量取1?L 反應液分別加入上述兩個薄壁管中，其后將管蓋蓋緊并混合均勻，置于離心機中瞬時離心，其后取出放置一旁待用。

1.2.3 待檢測DNA 樣本的配制 分別準確量取3?L 對待測基因組DNA 加入上述離心后的兩個薄壁管中，為使混合后的體積達到50?L，應分別量取17?L ddH2O 加入薄壁管中，其后將管蓋蓋緊并混合均勻，置于離心機中瞬時離心以備后續(xù)操作。

1.2.4 PCR 擴增 打開PCR 儀并將PCR 管置于其中，依照50℃ 2 min;95℃ 5 min;94℃ 30 sec、60℃ 30 sec、65℃1 min（26Cycles）;65℃ 10 min;4℃ Hold 程序進行擴增。操作完成后，將擴增后的產(chǎn)物取出移至2℃～8℃環(huán)境中進一步保存以備后續(xù)操作。

1.2.5 檢測卡檢測實驗 從密封袋中取出檢測卡，分別在對應的樣品墊上滴加上述兩個薄壁管中的擴增產(chǎn)物，靜待2～5 min 判讀檢測結果，為保證結果的準確性，應確保在20min 內(nèi)完成判讀。

1.2.6 結果判讀 將待測樣本M 與WT 管中的PCR 產(chǎn)物進行滴加檢測，在檢測結果中，C677T 位點的基因型主要是依據(jù)是否有條帶出現(xiàn)而判定的。具體觀察檢測卡T 線處是否有條帶，若兩管中的產(chǎn)物均有，為雜合突變型（677CT 型）;若WT 管產(chǎn)物有而M 管產(chǎn)物無，為野生型（677CC 型）;若M 管產(chǎn)物有而WT管產(chǎn)物無，為純合突變型（677TT 型）。無效判定：檢測卡變質(zhì)或錯誤操作可導致指控線（C 線） 不出現(xiàn)條帶。針對上述情形，應更換合格的檢測卡并準確依照說明書進行再次操作。

1.2.7 質(zhì)量控制 ①在陽性對照卡上有條帶出現(xiàn)則為陽性對照，反之，在陰性對照卡上無條帶出現(xiàn)則為陰性對照。應確保定期針對上述兩種對照品進行實驗。②陽性對照品實驗：取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，分別準確量取20?L M 陽性對照液與WT 陽性對照液加入相同標注管中，其后分別量取1?L 反應液+29?L M擴增液、1?L 反應液+29?L WT 擴增液加入對應的薄壁管中，并重復上述PCR 擴增、檢測、判讀步驟，條帶出現(xiàn)在T線與C 線處。③陰性對照品實驗：取無菌0.2 mL PCR 薄壁管兩支并將M、WT 分別標注于管蓋上，分別量取1?L 反應液+29?L M 擴增液、1?L 反應液+29?L WT 擴增液加入對應的薄壁管中，準確量取20?L 陰性對照液加入其中，并重復上述PCR 擴增、檢測、判讀步驟，T 線處無條帶而C 線處有條帶。

對于檢測結果中，依據(jù)文獻和臨床研究報道：當MTHFRC677T 發(fā)生純合突變則酶活性降低，對葉酸的吸收代謝產(chǎn)生影響;MTHFR C677T發(fā)生雜合突變則酶活性中等，對葉酸代謝吸收產(chǎn)生一定影響;MTHFR C677T 不發(fā)生突變即野生型則酶活性高，葉酸代謝吸收正常。具體資料見表1。

2 結果

2.1 方法學性能評價

2.1.1 基因型各濃度樣本的檢出率 評價方案：選取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 雜合突變型）、MTHFR 677TT型（ 純合突變型） 樣本，分別檢測兩個不同濃度5 ng/μL 和10 ng/μL，按照不同濃度，上述三種基因型分別進行3 次檢測，統(tǒng)計各基因型各濃度樣本的檢出率。具體資料見表2。

判定標準：檢出率達100% 的最低樣本濃度即為本實驗方法的檢測下限。

驗證結果：濃度為5ng/uL 時，檢出率100%，條帶清晰、明確。

2.1.2 符合率實驗 評價方案：取已知MTHFR 基因型DNA 樣本20 例（ 覆蓋MTHFR 三種基因型），編盲后進行MTHFR 基因型檢測（ 在陰、陽性質(zhì)控在控的情況下對結果進行評價分析），檢測結果與已知的第三方雙向測序結果比對，比較二者的符合率。

判定標準：總體符合率95% 為判斷標準。

驗證結果：共測序比對20 例。其中，CC 型6 例，CT 型7例，TT 型7 例。CC 符合率100%，CT 符合率100%，TT 符合率100%，總符合率100%。

2.1.3 精密度實驗 評價方案：選取MTHFR 677CC 型（ 野生型）、MTHFR 677CT 型（ 雜合突變型）、MTHFR 677TT 型（ 純合突變型） 樣本，持續(xù)測試5 d，每個樣本每天重復3 次。

具體資料見表3。

判定標準：檢測每天重復結果，基因型符合率大于95%為判斷標準。

驗證結果：5 d 實驗結果比對總符合率100%。

2.2 本文性能驗證項目 采用PCR+ 金標免疫層析法的快速分析技術，以金磁微粒為標記載體，建立了MTHFR C677T基因快速層析檢測系統(tǒng)。在實驗室項目評估中，精密度指提示結果的一致性，準確度衡量結果與真值之間的關系，而好的精密度與良好的準確度相關。這兩者都是評估實驗室項目的重要組成部分。本次性能驗證的結果表明：該方法具有高精密度和符合率，在臨床應用中的安全性和有效性均能保證。該檢測方法與其他方法相比也擁有許多優(yōu)勢。首先，該產(chǎn)品具有獨特的設計原理，不僅操作簡單，而且快捷，比芯片法節(jié)約近3 個小時，比測序法更節(jié)約時間，可以高通量測試，時間和人力成本明顯節(jié)約，結果準確，可以滿足大型醫(yī)療機構對基因型檢測樣本量較大的要求。UNG 酶的采用，避免了PCR 產(chǎn)物進行層析檢測過程中的污染發(fā)生。同時，該試劑盒使用過程中無需大型測序儀器，無需專業(yè)的生物芯片雜交儀和掃描儀等，只需要普通的PCR 測序儀，就可以完成對MTHFR C677T 位點的基因檢測，這一點也解決了三級以下醫(yī)院設備簡陋的問題，有利于檢測項目在小醫(yī)院的開展，很大程度也方便了孕婦進行產(chǎn)前檢查，有助于項目的普及。MTHFRC677T 多態(tài)性檢測試劑盒的性能驗證結果與廠商提供的數(shù)據(jù)基本一致。經(jīng)性能驗證實驗證明該試劑盒基本滿足對產(chǎn)婦進行產(chǎn)前篩查的要求，可以應用于臨床檢測。

3 討論

婦幼保健方面，針對中國人的相關亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性主要集中在MTHFR 基因C677T 的位點多態(tài)性研究上[3-4]，這是毋庸置疑的。本報告雖然對實驗方法學性能作了評價，結果顯示檢測下限、符合率、精密度、準確性均符合要求。但臨床診斷性能包括臨床特異性、敏感性、陽性預測值、陰性預測值、似然比、一致性等臨床診斷性能，這也是今后計劃工作的一部分。每一種實驗方法都存在假陰性和假陽性，假陰性高表示漏診率高。樣本采集的問題也是假陰性重要因素，而更應該引以關注的是某項指標陽性與實際發(fā)病的關系。實驗中也應盡可能繼續(xù)結合遺傳因素、環(huán)境回素、自身免疫狀況及食物營養(yǎng)等多因素與產(chǎn)前MTHFRC677T 基因檢測綜合分析新生及孕婦可能發(fā)生的各種狀況。

MTHFR C677T 突變與新生兒缺陷有關，但不是唯一的致病因素，MTHFR C677T 多態(tài)性檢測這一性能評價也僅僅是產(chǎn)前篩查的一個質(zhì)量保證，多指標聯(lián)合檢測也是減少漏診的重要方法[5-6]。其結果的判讀應用在于提示同型半胱氨酸的升高和葉酸的降低，才能對可能出現(xiàn)的高同型半胱氨酸和葉酸的異常代謝和缺乏給予適當?shù)念A防、適量的補充，有助于指導孕婦服用葉酸，及時干預，對避免新生兒缺陷有重要意義。