李擁軍，陳雯，皮小弟，鄔婷，周凱

（1.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院南藥學(xué)院，廣東江門 529000）（2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東廣州 510730）（3.九江學(xué)院江西油茶研究中心,藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 332005）

白酒是“世界八大烈酒”之一，由于其獨(dú)特的風(fēng)味和悠久的飲酒文化，深受我國廣大消費(fèi)者的青睞。然而飲酒時也可能攝入一些有害物質(zhì)，如氨基甲酸乙酯（EC），一種 2A類的致癌物（國際癌癥研究機(jī)構(gòu)，IARC，2007），普遍存在于發(fā)酵食品與酒精飲料中[1]。針對飲酒攝入的高風(fēng)險水平的 EC，許多國家已經(jīng)制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，例如加拿大和捷克規(guī)定谷物蒸餾酒中EC含量不得超過150 μg/L[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，我國的部分地區(qū)白酒中EC含量超過了這一水平，最大含量高達(dá)1680 μg/kg，嚴(yán)重影響了我國白酒的世界化進(jìn)程，危害了消費(fèi)者健康[3-5]。因此，降低白酒中 EC含量勢在必行。

迄今為止，飲料酒中的EC形成途徑已有基本定論，主要是在生產(chǎn)過程中通過前體物質(zhì)與乙醇發(fā)生反應(yīng)形成EC，目前發(fā)現(xiàn)的EC前體有：尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、焦碳酸二乙酯和氰酸[2,6]。不同香型白酒的生產(chǎn)工藝各異，但均需要經(jīng)過發(fā)酵和蒸餾兩個步驟，現(xiàn)有研究表明尿素和瓜氨酸均顯著影響EC形成[7,8]。在蒸餾過程中，高溫顯著促進(jìn)了前體物質(zhì)與乙醇反應(yīng)形成EC；加上白酒“越釀越香”，貯藏時間長，也會形成大量的 EC，因此許多研究集中在揭示蒸餾與貯藏過程中EC形成規(guī)律[9-11]。然而，前體物質(zhì)中瓜氨酸與尿素的形成在很大程度上與發(fā)酵微生物有關(guān)，其中釀酒酵母能夠?qū)⒕彼岽罅哭D(zhuǎn)化成尿素，而具有精氨酸脫亞氨基（ADI）途徑的細(xì)菌則能代謝精氨酸形成瓜氨酸[1,5,6]，二者的積累均主要發(fā)生在酒醅發(fā)酵過程中。因此，本文選取了濃香型與芝麻香型兩種具有代表性的白酒，探究白酒固態(tài)發(fā)酵過程中EC及其主要前體物質(zhì)的形成規(guī)律，以期為針對性的減少EC含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

濃香型和芝麻香型固態(tài)酒醅取自安徽某酒廠，酒醅發(fā)酵時間跨度為2020年9月至2020年11月之間，由于窖池不同部位發(fā)酵差異較大，每次取樣時將窖池深度分成四等分，在中間兩等分點(diǎn)中靠近窖池中部取樣，每個深度中取樣三個位置，最后將上述樣品混勻，共得約1800 g樣品。

氨基甲酸乙酯（EC）、氨基甲酸丁酯（BC）、二氯甲烷、乙腈等色譜純試劑購買于上海阿拉丁試劑公司，占噸醇、氫氧化鈉、尿素、乙醇、瓜氨酸、精氨酸等分析純購買于天津希恩思試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

將獲取的酒醅樣品均分成三份后分裝入無菌的自封袋內(nèi)，密封后置于-20 ℃保藏，待所有酒醅樣品收集完成后再立即進(jìn)行分析。

為了探究酒醅發(fā)酵過程中尿素與瓜氨酸對EC形成的影響，取發(fā)酵一周后的酒醅樣品平均分成2份，每份600 g，一份加入60 mg尿素（即酒醅中尿素含量增加了100 mg/kg），另一份加入24 mg瓜氨酸（即酒醅中瓜氨酸含量增加了 40 mg/kg）?；旌暇鶆蚋髯苑殖扇莺笱b入棕色試劑瓶中，密封后置于 35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至窖池樣品發(fā)酵結(jié)束。為了驗(yàn)證酒醅發(fā)酵初期pH值對EC形成的影響，將初始發(fā)酵酒醅pH值調(diào)節(jié)成5、4.5、4和3.5（先測定酒醅pH值，利用乙酸/氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至相應(yīng)pH值并記錄消耗的體積，然后在酒醅中加入相應(yīng)體積的乙酸/氫氧化鈉溶液），分別裝入棕色試劑瓶中，密封后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基甲酸乙酯含量測定

樣品前處理參考GB 5009.223-2014并稍做修改。在50 mL離心管中加入5 g樣品和50 μL BC內(nèi)標(biāo)（1 μg/mL），再加入10 mL蒸餾水和1 g氯化鈉，超聲溶解混勻，5000 r/min離心5 min，將上清液加樣至CNW BOND固相萃取小柱（上海安譜），靜置10 min后，先用15 mL正己烷淋洗后，用20 mL 5%的乙酸乙酯-乙醚洗脫，控制洗脫流速1滴/s。將洗脫液收集到離心管后加入2 g無水硫酸鈉除水后，室溫下用氮?dú)饩従彺抵两桑燃淄槎ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾后供GC-MS分析。

采用VF-WAX（30 m×0.25 mm、0.25 μm）色譜柱，氣相色譜質(zhì)譜型號為Agilent 7890A-5975C（美國安捷倫），色譜參數(shù)設(shè)置為：氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min。進(jìn)樣口和傳輸線溫度分別為220 ℃和250 ℃，氣體洗脫程序設(shè)置為初始溫度50 ℃，保持1 min, 以8 ℃/min加熱至 180 ℃后再以 40 ℃/min加熱至240 ℃，保持5 min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1.0 μL。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定為：采用EI源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃。采用SIM模式掃描，特征離子為62、74和89，為了提高靈敏度選擇62為定量離子。

1.3.2 乙醇含量測定

取10 g樣品置于250 mL錐形瓶中，加入40 mL蒸餾水，充分混合振蕩后過濾，收集濾液后離心取上清液待測。乙醇測定采用重鉻酸鉀比色法[12]：重鉻酸鉀（2 mL，4%）、濃硫酸（2.5 mL）和1 mL樣品加入25 mL比色管中，混合后沸水浴10 min，冷卻至室溫后利用分光光度計(jì)測定600 nm吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙醇含量。

1.3.3 尿素含量測定

尿素含量采用輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) QB/T 4710-2014進(jìn)行測定，取1.3.2中上清液待測樣品600 μL，加入400 μL的占噸醇（0.02 mol/L，溶于正丙醇）衍生化試劑，并加入100 μL1.5 mol/L的鹽酸溶液，漩渦震蕩1 min，避光在25 ℃下反應(yīng)30 min，反應(yīng)液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后供高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器分離檢測。以保留時間定性，采用峰面積外標(biāo)法定量。色譜柱選擇ZORBAX SB-C18柱，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。熒光檢測器激發(fā)波長為240 nm，發(fā)射波長為308 nm。

1.3.4 精氨酸與瓜氨酸含量測定

瓜氨酸和精氨酸的含量測定參考 Zhou[13]的方法利用分光光度法稍加修改。將40 g/L NaOH、80 g/L甲萘酚和0.5 mL/L雙乙酰（用正丙醇溶解）各1 mL加入10 mL比色管中，然后加入100 μL適當(dāng)稀釋的樣品（或標(biāo)準(zhǔn)溶液），混勻后在 30 ℃水浴中保溫 15 min，冷卻室溫后測 OD540，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出精氨酸含量。取2 mL稀釋的樣品（或標(biāo)準(zhǔn)溶液），加入1 mL混合酸（V/V=1:3）和0.125 mL二乙酰一肟（30 g/L），混勻后避光沸水浴30 min，繼續(xù)避光冷卻至室溫后利用分光光度計(jì)測定490 nm下的吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算瓜氨酸含量。

1.3.5 pH值與總酸含量測定

將40 mL蒸餾水與10 g樣品置于250 mL錐形瓶中，在25 ℃條件下充分混合振蕩20 min，采用pH計(jì)測定樣品的pH值。將混合振蕩的樣品過濾，稀釋十倍后，吸取50 mL樣品于25 mL錐形瓶中，加入酚酞指示劑后，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定，以100 g酒醅消耗的NaOH的毫摩爾數(shù)記為度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22進(jìn)行單因素方差分析與雙變量相關(guān)性分析，確定p<0.05的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異與p<0.01的極顯著差異。采用OriginPro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒固態(tài)發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯的形成

酒醅固態(tài)發(fā)酵過程中EC含量如圖1所示，酒醅發(fā)酵初期即檢測出可觀的EC含量，芝麻香型和濃香型酒醅中分別為29.39 μg/kg和20.37 μg/kg。兩種香型酒醅發(fā)酵第1周EC含量均未顯著變化，隨著發(fā)酵時間的延長，酒醅中的EC含量逐漸增加。其中濃香型白酒EC形成速率較慢，直到發(fā)酵末期才顯著增加至76.04 μg/kg，其含量相比于發(fā)酵初期增加了272.93%；芝麻香型酒醅在發(fā)酵2~4周內(nèi)EC含量急劇增加，盡管發(fā)酵時間較濃香型酒醅短，但芝麻香型酒醅中 EC形成速率（4.40×10-7μmol/kg·s）和含量（140.55 μg/kg）均顯著高于濃香型酒醅（圖1），也顯著高于醬油醬醅與醬香型白酒酒醅[14,15]，但與報道的濃香型白酒酒醅相當(dāng)[16]。

圖1 酒醅窖池發(fā)酵與模擬發(fā)酵過程中EC含量變化Fig.1 Time-dependent actual and simulated variation in EC concentration of fermenting grains during Baijiu preparation

2.2 白酒固態(tài)發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯相關(guān)前體物質(zhì)含量變化

乙醇是酒醅發(fā)酵主要產(chǎn)物，也是檢測酒醅發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。固態(tài)酒醅中乙醇含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加（圖2），其中芝麻香型酒醅在發(fā)酵3周后乙醇含量達(dá)到穩(wěn)定，為4.52%~4.66%，濃香型酒醅發(fā)酵1周后乙醇含量迅速增加至3.25%，隨著發(fā)酵時間延長緩慢增加至4.02%。經(jīng)測定，酒醅中水分含量在60%左右，根據(jù)乙醇和前體物質(zhì)的摩爾質(zhì)量計(jì)算，乙醇摩爾質(zhì)量濃度為瓜氨酸和尿素的102~103倍，即在整個發(fā)酵過程中EC形成階段，乙醇含量均為過量狀態(tài)。

圖2 白酒固態(tài)發(fā)酵過程中乙醇、精氨酸、瓜氨酸與尿素含量變化情況Fig.2 Ethanol, arginine, citrulline, and urea concentrations over the course of solid-state Baijiu fermentation

濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中游離精氨酸含量呈現(xiàn)波浪式上升趨勢（圖2），從發(fā)酵初期的129.66 mg/kg增加到218.69 mg/kg。而在芝麻香型酒醅中，精氨酸含量在發(fā)酵第1周增加至最高（276.98 mg/kg），發(fā)酵2~4周內(nèi)精氨酸含量逐漸降低，經(jīng)過最后2周發(fā)酵精氨酸含量增加至209.46 mg/kg。精氨酸是一種蛋白質(zhì)氨基酸，游離的精氨酸主要通過蛋白質(zhì)水解微生物轉(zhuǎn)化獲得，EC重要前體物質(zhì)瓜氨酸與尿素則主要由微生物代謝精氨酸產(chǎn)生[6]。尿素主要通過酵母的尿素循環(huán)產(chǎn)生，在氮代謝阻遏效應(yīng)調(diào)控下造成尿素的積累[5,6]。本研究中的兩種香型的白酒酒醅中尿素在發(fā)酵前3周均顯著增加，這與乙醇的積累結(jié)果一致（圖1）。芝麻香型酒醅發(fā)酵末期尿素含量較濃香型酒醅高約25 mg/kg。瓜氨酸含量變化在兩種香型酒醅發(fā)酵過程中表現(xiàn)不同：在芝麻香型酒醅中，發(fā)酵前兩周內(nèi)的瓜氨酸含量持續(xù)增加，但在第三周急劇下降，在發(fā)酵末期提高至53.56 mg/kg；在濃香型酒醅中，瓜氨酸含量在整個發(fā)酵過程中均持續(xù)增加，最終含量為 56.67 mg/kg。發(fā)酵過程中瓜氨酸的積累主要由具有精氨酸脫亞氨基途徑（ADI途徑）的細(xì)菌代謝精氨酸產(chǎn)生[17]，兩種香型酒醅的瓜氨酸在發(fā)酵中后期積累較多，研究此發(fā)酵階段的細(xì)菌代謝精氨酸規(guī)律有利于控制瓜氨酸的積累。

2.3 白酒固態(tài)發(fā)酵過程中pH值及酸度指標(biāo)的變化

白酒酒醅固態(tài)發(fā)酵過程中，水分含量維持在40%~60%，大量特定微生物在此環(huán)境中生長代謝，環(huán)境中的酸度和pH值對優(yōu)勢菌生長代謝影響很大，是酒醅群落演替中關(guān)鍵推動力[18]。因此，監(jiān)測酒醅中總酸度與pH值，對于了解發(fā)酵安全與品質(zhì)十分必要。如圖3所示，酒醅中總酸度隨著發(fā)酵時間的延長而升高，pH值則下降。其中芝麻香型酒醅初始總酸度高于濃香型，pH值則低于濃香型酒醅。隨著發(fā)酵時間延長，濃香型酒醅的總酸度增加速度和pH值下降速度均高于芝麻香型酒醅，但并不同步進(jìn)行。濃香型酒醅的總酸度在發(fā)酵3周后才超過芝麻香型酒醅，而pH值則在第2周內(nèi)即低于芝麻香型酒醅。值得注意的是，白酒固態(tài)發(fā)酵1周時pH值均升高，發(fā)酵2周后兩種白酒酒醅的pH值均維持在4.0以下，這有助于乳酸菌生長代謝[19]，也有助于EC的形成[20]。曹云剛[21]指出酒醅總酸度的變化趨勢與pH值大體一致，但并不完全相同，在汾酒酒醅中發(fā)酵初期的總酸度增加，pH值反而略有上升，這與本研究中的兩種酒醅一致，濃香型白酒總酸度與pH值變化更大。

圖3 白酒固態(tài)發(fā)酵過程中總酸度及pH值變化情況Fig.3 Changes in total acidity and pH over the course of solid-state Baijiu fermentation

2.4 酒醅發(fā)酵過程中EC與主要指標(biāo)相關(guān)性分析

芝麻香型和濃香型白酒酒醅固態(tài)發(fā)酵過程中 EC及其相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析分別如表1和表2所示，兩種酒醅發(fā)酵過程中乙醇與總酸度和pH值變化顯著相關(guān)，這與固態(tài)發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物生長相關(guān)[18]；EC含量與乙醇含量和總酸度在兩種酒醅中均呈極顯著正相關(guān)；尿素與瓜氨酸在芝麻香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中與EC相關(guān)性均不顯著（p>0.05）；在濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中EC與瓜氨酸呈極顯著正相關(guān)，與尿素含量顯著相關(guān)。以上結(jié)果可能的原因有：1）pH值影響瓜氨酸和尿素與乙醇反應(yīng)形成 EC，本研究中發(fā)現(xiàn)兩種酒醅pH值在4.0時EC開始顯著積累，發(fā)酵2周后酒醅pH值接近4.0，盡管前兩周瓜氨酸和尿素含量均有增加，但EC積累呈現(xiàn)滯后趨勢；2）由于酒醅發(fā)酵溫度較低（酒醅溫度為32 ℃~38 ℃），瓜氨酸與尿素形成EC的轉(zhuǎn)化率極低（約10-3），前體物質(zhì)的變化并不全部形成EC；3）酒醅為固態(tài)發(fā)酵，水分含量約50%，大部分只是浸潤發(fā)酵基質(zhì)，并不形成一個連續(xù)的溶劑環(huán)境，導(dǎo)致部分微生物代謝形成的前體物質(zhì)并不能迅速轉(zhuǎn)化成 EC。在兩種酒醅發(fā)酵過程中精氨酸與瓜氨酸的含量均呈極顯著相關(guān)，而與尿素相關(guān)性不顯著。尿素可從發(fā)酵原料中帶入，也能通過精氨酸轉(zhuǎn)化形成；而瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，主要通過微生物代謝產(chǎn)生[5,6]。近年來隨著對瓜氨酸積累關(guān)鍵發(fā)酵細(xì)菌的深入研究，有望通過調(diào)節(jié)精氨酸代謝來降低瓜氨酸含量，進(jìn)而控制EC積累。

表1 芝麻香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中EC、乙醇、尿素、精氨酸、瓜氨酸、總酸度和pH值之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation coefficients between EC, ethanol, urea, arginine, and citrulline contents, total acidity, and pH during grain fermentation in sesame-flavored Baijiu

表2 濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中EC、乙醇、尿素、精氨酸、瓜氨酸、總酸度和pH之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients between EC, ethanol, urea, arginine, and citrulline contents, total acidity, and pH during grain fermentation in strongly flavored Baijiu

2.5 pH值、尿素與瓜氨酸對白酒固態(tài)發(fā)酵過程中氨基甲酸乙酯形成的影響

為了深入驗(yàn)證發(fā)酵初期pH值對EC積累的影響并探究發(fā)酵過程中尿素與瓜氨酸形成EC的能力，將發(fā)酵初期酒醅pH值調(diào)節(jié)成3.5~5，另在發(fā)酵1周的酒醅中添加尿素與瓜氨酸（添加含量為酒醅發(fā)酵階段尿素與瓜氨酸含量平均值的近似值，分別為 100 mg/kg尿素與40 mg/kg瓜氨酸）后，進(jìn)行模擬發(fā)酵，其結(jié)果見圖1與圖4。如圖1所示，添加了尿素與瓜氨酸后，兩種酒醅隨著發(fā)酵時間的延長，處理組中EC含量均顯著高于對照組。假設(shè)添加的瓜氨酸與尿素只參與EC形成，則瓜氨酸與尿素在芝麻香型酒醅中轉(zhuǎn)化率（增加的EC物質(zhì)的量/添加的尿素或瓜氨酸物質(zhì)的量）分別為4.43×10-4和2.50×10-4，在濃香型酒醅中轉(zhuǎn)化率分別為5.85×10-4和2.06×10-4，即瓜氨酸在酒醅中轉(zhuǎn)化成EC能力高于尿素。但實(shí)際上，尿素與瓜氨酸不只參與形成EC，且酒醅中尿素含量遠(yuǎn)高于瓜氨酸（圖2），尿素處理組形成的 EC含量均顯著高于瓜氨酸添加組。在添加尿素與瓜氨酸后3周后，處理組酒醅與對照組酒醅EC含量差值不再增加，在濃香型酒醅中反而有所降低。以上現(xiàn)象表明：1）酒醅中尿素與瓜氨酸均能夠促進(jìn)EC的積累，由于酒醅中尿素含量更高，形成的EC更多；2）尿素與瓜氨酸均由酒醅中部分微生物產(chǎn)生，且濃度遠(yuǎn)低于乙醇，由于酒醅是固態(tài)發(fā)酵，酒醅中形成的尿素和瓜氨酸與乙醇反應(yīng)能力顯著弱于在溶液環(huán)境中，EC轉(zhuǎn)化率很低；3）在酒醅發(fā)酵后期，尿素與瓜氨酸趨于動態(tài)平衡，EC的形成逐漸穩(wěn)定。芝麻香型和濃香型酒醅發(fā)酵初始時pH值分別為4.26和4.93，調(diào)節(jié)酒醅pH值后發(fā)酵1周EC含量如圖4所示。將兩種香型酒醅pH值調(diào)節(jié)為4.0以下，EC形成量均高于對照組，其中芝麻香型和濃香型酒醅 pH值分別調(diào)節(jié)為4.0和3.5的處理組在發(fā)酵1周后EC含量顯著高于初始值、對照組、pH值為5和4.5的處理組。故推斷發(fā)酵初期pH值可能是影響EC形成的重要因素之一。

圖4 pH值對酒醅發(fā)酵初期EC形成的影響Fig.4 Effects of pH on EC formation during early stage Baijiu fermentation

3 討論

我國白酒香型分類較多，生產(chǎn)工藝各異，本文選取了濃香型與芝麻香型兩種白酒，分析其酒醅在發(fā)酵過程中的EC形成情況。濃香型酒醅由白酒母糟蒸餾后拌曲制備，而芝麻香型酒醅發(fā)酵前需要經(jīng)過高溫堆積[22]，圖1顯示酒醅固態(tài)發(fā)酵初期就能檢測出可觀的EC含量，在芝麻香型和濃香型酒醅中含量分別為29.39 μg/kg 和 20.37 μg/kg。根據(jù)濃香型生產(chǎn)工藝推測，濃香型酒醅發(fā)酵初期 EC主要來源于母糟蒸餾后殘留，除去蒸酒后樣品中的EC及其前體有利于降低酒醅中EC含量；而芝麻香型酒醅EC來源于高溫堆積過程（原料蒸料攤涼后并未檢出EC），以堆積時間約3 d 計(jì)算，EC 形成速率為1.27×10-6μmol/kg·s，顯著高于窖池中芝麻香型酒醅發(fā)酵時產(chǎn)生EC的速率。盡管芝麻香型白酒酒醅堆積過程中EC前體物質(zhì)含量均低于窖池發(fā)酵，但酒醅在堆積過程中溫度（45~50 ℃）顯著高于在窖池中的發(fā)酵溫度（一般不超過40 ℃），說明溫度對EC形成速率影響極大，控制發(fā)酵溫度是關(guān)鍵。

隨著酒醅發(fā)酵時間的延長，EC含量逐漸增加，相比于發(fā)酵初期，發(fā)酵末期的濃香型酒醅和芝麻香型酒醅EC含量分別增加了111.16 μg/kg和55.65 μg/kg，酒醅中的EC很容易在蒸餾過程中轉(zhuǎn)移至白酒中[9,23]。因此研究不同香型酒醅發(fā)酵過程中EC變化規(guī)律，針對性的控制酒醅發(fā)酵過程中EC形成十分必要。本研究中芝麻香型酒醅在發(fā)酵過程中積累的EC含量為濃香型白酒醅的近兩倍，也普遍高于其他白酒[4,8,21]，需要重點(diǎn)關(guān)注。兩種酒醅發(fā)酵過程EC主要形成期不同，芝麻香型酒醅EC含量在發(fā)酵2~4周增加迅速，占總增加量的83.02%；而濃香型酒醅發(fā)酵最后10 d EC含量占總增加量的44.06%，為主要積累期。

在不同香型白酒及其生產(chǎn)工藝階段中，EC主要前體物質(zhì)有極大差別。梁晨[14]分析了芝麻香型白酒與醬香型白酒在發(fā)酵過程中EC與尿素含量變化情況，發(fā)現(xiàn)尿素與EC含量變化顯著相關(guān)，而瓜氨酸含量變化與EC變化不顯著，指出尿素是兩種香型白酒中EC形成的主要前體物質(zhì)，林建春[7]的結(jié)果也支持該結(jié)論，但二者均未通過發(fā)酵添加實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。仇鈺瑩[8]認(rèn)為原酒中EC的主要前體物質(zhì)是尿素和瓜氨酸，且酒醅發(fā)酵過程中瓜氨酸含量增幅達(dá)63.90%。本研究中兩種酒醅在發(fā)酵過程中瓜氨酸增加量均高于尿素含量，且濃香型白酒酒醅中瓜氨酸與EC含量變化呈極顯著相關(guān)（圖2）。瓜氨酸沸點(diǎn)低于尿素，在白酒實(shí)際生產(chǎn)過程中，瓜氨酸對白酒蒸餾階段與儲酒階段的EC含量的影響不可忽視[10]。在模擬實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加的瓜氨酸和尿素均能顯著增加酒醅中EC含量，尿素處理組形成的EC含量均顯著高于瓜氨酸添加組。

酒醅發(fā)酵1周時尿素、瓜氨酸與乙醇含量均顯著增加，但EC含量直到第二周才顯著增加。分析發(fā)現(xiàn)EC與酸度和pH值具有較高的相關(guān)性，且發(fā)酵1周內(nèi)酒醅pH值均高于4.0，推測pH值對發(fā)酵初期EC形成有影響。目前只有少數(shù)研究關(guān)注pH值對EC積累的影響，周佳[24]發(fā)現(xiàn)低pH值環(huán)境下能夠阻礙腐乳中EC形成，但在醬油模擬滅菌過程中pH值在5.0以下EC形成顯著增加[15]，大多數(shù)模擬EC形成條件時均采用pH值為4.5左右的酸性環(huán)境[22,23]，推測低pH值環(huán)境有助于EC的形成。模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒醅發(fā)酵一周后在pH值為4.0和3.5的處理組中EC含量相比于對照組顯著增加（p<0.05），而pH值高于4.0則變化不大，故推斷pH值可能是影響發(fā)酵初期EC形成的重要因素，但在酒醅pH值在4.0和3.5時對EC形成影響不大（圖4）。

4 結(jié)論

4.1 兩種香型白酒酒醅在固態(tài)發(fā)酵初期均檢測到EC，芝麻香型和濃香型白酒酒醅發(fā)酵過程中EC積累量遠(yuǎn)高于發(fā)酵初期。酒醅發(fā)酵初期EC形成主要受pH值影響，酒醅pH值低于4.0有利于EC的形成。芝麻香型酒醅EC主要積累期為發(fā)酵2~4周，占整個發(fā)酵過程中EC形成量的83.02%，濃香型酒醅EC主要積累于發(fā)酵后期。

4.2 兩種香型白酒酒醅在發(fā)酵過程中瓜氨酸增加量均高于尿素。尿素在發(fā)酵前3周含量顯著增加，而瓜氨酸主要積累于發(fā)酵后期。在模擬實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加的瓜氨酸和尿素均能顯著增加酒醅中EC含量，尿素在酒醅發(fā)酵環(huán)境中轉(zhuǎn)化成EC含量更多。