結(jié)球甘藍(lán)無蠟粉亮葉性狀dCAPS標(biāo)記引物優(yōu)化

王超，付天姿，張曉烜，李秀樂

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）簡稱甘藍(lán)，是十字花科蔬菜中重要一種。航海大發(fā)現(xiàn)時代傳播到世界各地，明清時期傳入我國[1]。初蓮香等1993年初次發(fā)現(xiàn)結(jié)球甘藍(lán)無蠟粉亮綠型突變體[2]，該種突變體甘藍(lán)在生長階段植被表面均無蠟粉覆蓋，與普通結(jié)球甘藍(lán)相比差異顯著。Justus和Stoner等報道指出，小菜蛾和部分鱗翅目昆蟲等害蟲在蕓薹屬無蠟粉植株上具有產(chǎn)卵偏好性[3-4]，但瓢蟲成蟲和卵數(shù)量有所增加[5]，該害蟲天敵在無蠟粉植株上移動速度快于有蠟粉植株，益蟲捕食能力提高使無蠟粉亮綠植株對蕓薹屬常見害蟲具有一定抗性[6]。Cole等研究發(fā)現(xiàn)，無蠟粉亮綠性狀對植株本身而言，增加對水脅迫敏感性，這一現(xiàn)象導(dǎo)致植株體內(nèi)分泌阻止昆蟲取食化合物濃度升高[7]。此背景下，無蠟粉亮綠突變體研究對于抗蟲性等優(yōu)勢甘藍(lán)品種選育具有重要意義。

多種分子標(biāo)記技術(shù)已運(yùn)用于結(jié)球甘藍(lán)無蠟粉亮綠性狀和目的基因定位相關(guān)研究，董昕探究甘藍(lán)顯性蠟質(zhì)缺失基因BoGL-3定位與候選基因，通過BSA法篩選標(biāo)記，利用F2群體驗證標(biāo)記，將甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失基因BoGL-3定位在8號染色體末端83 kb區(qū)間內(nèi)[8]。劉東明對甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失基因BoGL-4作精細(xì)定位，利用SSR標(biāo)記精細(xì)定位，將目的基因BoGL-4定位在1號染色體170 kb區(qū)間內(nèi)[9]。李景濤選用無蠟粉亮綠結(jié)球甘藍(lán)10Q-961和普通有蠟粉結(jié)球甘藍(lán)10Q-206為父母本，在對目的基因定位時，利用gSSR和InDel多態(tài)性引物篩選F2群體，最終試驗結(jié)果表明，共顯性標(biāo)記Scaffold2324與突變體結(jié)球甘藍(lán)10Q-961基因gwl遺傳距離為6.5 cM[10]。

在現(xiàn)有分子標(biāo)記手段中，單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）與其他標(biāo)記方法相比，優(yōu)勢在于其遺傳穩(wěn)定性高、所在位點極具代表性且分布廣泛，已成為熱門分子標(biāo)記方法之一[11]。除此之外，SNP檢測方法較多，雖然大部分檢測方法存在成本過高或操作繁瑣等缺陷，遺傳育種領(lǐng)域存在一定局限性[12-13]。但CAPS標(biāo)記（酶切擴(kuò)增多態(tài)性，Cleaved amplified polymorphic sequences）和衍生CAPS（衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性，Derived cleaved amplified polymorphic sequences，dCAPS）是可將SNP多態(tài)轉(zhuǎn)化成可酶切擴(kuò)增的有效分子標(biāo)記方法[14]。已有報道中司文潔[15]、王彩芬[16]和雷天剛[17]等研究證明，CAPS標(biāo)記具有對DNA用量低、操作方便、共顯性明顯和多態(tài)性好等優(yōu)點，故在模式植物擬南芥[18]、大田作物小麥[19]和大麥[20]及水果蔬菜作物中應(yīng)用廣泛。dCAPS標(biāo)記開發(fā)具有一定復(fù)雜性，且因限制性內(nèi)切酶多樣性，dCAPS引物設(shè)計變得極其耗時，Li等開發(fā)批量開發(fā)工具（http://223.65.208.206.8018/）可直接設(shè)計引物對，且提供引物錯配等級[21]，還可使用Neff等開發(fā)dCAPS Finder 2.0軟件（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設(shè) 計dCAPS引 物[22]，該方 法 使dCAPS引物開發(fā)更方便快捷。

綜上，dCAPS標(biāo)記自發(fā)明以來憑借其位點多、高效快捷等特點在分子研究方面應(yīng)用廣泛，例如基因定位、品種品系鑒定、圖位克隆等方面。本試驗開展結(jié)球甘藍(lán)dCAPS分子標(biāo)記輔助育種，利用新概念分子育種理論和技術(shù)體系，實現(xiàn)從經(jīng)驗育種到高效育種的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而加快結(jié)球甘藍(lán)新品種選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

結(jié)球甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失突變材料“亮葉98-1030”，結(jié)球甘藍(lán)蠟質(zhì)正常的野生型材料“98-1030”，以及其有性雜交F1、F2代單株。材料表型如圖1所示，植株表現(xiàn)為亮葉色、有光澤，葉片表面和莖均無白色或灰白色粉狀蠟質(zhì)覆蓋，則為無蠟粉亮葉突變型植株；植株表現(xiàn)為灰綠色，葉片表面和莖上均有一層白色霜狀蠟質(zhì)，葉脈表現(xiàn)為白色或黃白色，則為有蠟質(zhì)正常型植株。以上材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院甘藍(lán)課題組提供，同年同一時期播種于溫室。

圖1 野生型98-1030及無蠟粉亮葉突變體98-1030對比Fig.1 Comparison of wild-type cabbage 98-1030 with bright-leaf mutant without wax powder

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗

試驗材料于2019年春播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站溫室內(nèi)，待兩葉一心時分苗于單個營養(yǎng)缽中并編號；在苗齡3~4片真葉時，調(diào)查性狀，根據(jù)表型性狀分離比作卡方檢驗。將編號植株分別取0.2 g，保存于-80℃條件下，備用。

1.2.2 親本基因重測序及候選SNPs挖掘

將結(jié)球甘藍(lán)野生型98-1030和無蠟粉亮葉突變型98-1030構(gòu)建DNA文庫作全基因組重測序，并篩選測序結(jié)果，與參考基因組作比對（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10901?genome_assembly_id=59537），利用比對結(jié)果檢測和篩選SNPs并注釋統(tǒng)計，以上部分由深圳華大基因股份有限公司完成。最后使用IGV軟件將測序所得的親本基因與參考基因組作比對，獲取目標(biāo)區(qū)間SNPs。

1.2.3 dCAPS引物的設(shè)計

基于篩選得到的20個SNP位點設(shè)計dCAPS引物：先利用dCAPS Finder 2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm）設(shè)計dCAPS標(biāo)記錯配引物，再利用Premier 5.0設(shè)計dCAPS標(biāo)記下游引物。錯配引物設(shè)計原則為上下游引物在23~25 bp之間，錯配堿基數(shù)為一個，PCR產(chǎn)物條帶在150~400 bp之間。上述引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，以PAGE方式純化。

1.2.4 dCAPS多態(tài)性引物篩選

dCAPS引物多態(tài)性篩選具體步驟為：

（1）采用改良CTAB法提取雙親以及F1的DNA，并利用設(shè)計好的dCAPS引物作PCR擴(kuò)增；

（2）記錄PCR產(chǎn)物電泳帶型，以條帶清晰、易于識別、可穩(wěn)定擴(kuò)增為篩選條件，使用對應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切，最后統(tǒng)計酶切產(chǎn)物條帶情況，篩選目標(biāo)引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)球甘藍(lán)無蠟粉亮葉98-1030遺傳模式分析

試驗所選5個F1單株全部表現(xiàn)為顯性野生性狀，于2018年4月開始授粉，6月獲得F2代，同年7月播種于溫室，分別編號，8月統(tǒng)計表型。F2代材料表現(xiàn)型分為無蠟粉亮葉型和表面蠟質(zhì)正常型兩類，表型性狀統(tǒng)計結(jié)果為，無蠟粉亮葉型和表面蠟質(zhì)正常型比例接近1∶3.95，經(jīng)卡方檢驗（x2=10.65>x20.05=3.841）與孟德爾3∶1分離比例相差較大。此現(xiàn)象可能是因為F2群體較小，且僅來自3株F1植株造成。本課題組牟香麗等試驗結(jié)果證明結(jié)球甘藍(lán)98-1030無蠟粉亮葉控制基因為一對隱性基因控制的質(zhì)量性狀[23]，遵循孟德爾遺傳定律。

2.2 DNA提取與檢測

按照改良CTAB方法提取野生型98-1030、突變型無蠟粉亮葉98-1030、F1及F2群體基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，DNA樣品條帶如圖2所示，條帶清洗、無降解、無拖尾，證明DNA樣品提取質(zhì)量較高，可開展下一步試驗，將提取后DNA原液放置-20℃溫度下保存，使用時稀釋5倍作為工作液用于PCR擴(kuò)增。

圖2 主要材料DNA檢測結(jié)果Fig.2 DNA test results of main materials

應(yīng)注意的是，PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物檢測方法不同。PCR產(chǎn)物檢測步驟為，待PCR反應(yīng)完成后，配置濃度為1.5%瓊脂糖凝膠，以120 V電壓電泳，時長20 min。PCR產(chǎn)物酶切電泳方法為：待酶切完成后，配置濃度為3%瓊脂糖凝膠，以80 V電壓電泳，時長1.5 h。

2.3 基于雙親轉(zhuǎn)錄組測序SNP分析

利用雙親全基因組重測序比對分析發(fā)現(xiàn)，一些可能影響基因功能的SNP分布情況如下：6 652個SNP參與密碼子的提前終止；1 395個SNP將終止密碼子替換為其他氨基酸殘基，使該SNP所在DNA片段翻譯出更長開放閱讀框；還有2 442個SNP可改變基因組上的剪接供體及受體位點；9 325個SNP導(dǎo)致甲硫氨酸殘基改變。最后根據(jù)測序結(jié)果注釋信息在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)篩選出20個SNPs篩選dCAPS引物。

2.4 dCAPS標(biāo)記轉(zhuǎn)化

根據(jù)親本基因組重測序結(jié)果在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)選擇20個SNP位點，將其轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記，得到20對可用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段包含特異性酶切位點dCAPS引物，分別編號為DC01~DC20。

以引物DC01為例，設(shè)計方法和原理見圖3，該引物所使用限制性內(nèi)切酶AvaII識別序列為GGW?CC，序列中W為A和T簡并堿基國際通用代碼。

圖3 dCAPS引物DC01設(shè)計Fig.3 Design of primer DC01 for dCAPS

所設(shè)計上下游引物序列及所對應(yīng)限制性內(nèi)切酶見表1，表中加粗斜體字母為錯配堿基。

表1 根據(jù)SNP位點設(shè)計的dCAPS引物Table 1 dCAPS primers designed according to SNP

2.5 dCAPS標(biāo)記篩選

將20對dCAPS引物開展野生型結(jié)球甘藍(lán)98-1030和無蠟粉亮葉突變型結(jié)球甘藍(lán)98-1030以及F1代PCR擴(kuò)增及酶切。PCR結(jié)果表明，有10對引物可擴(kuò)增出產(chǎn)物條帶；酶切驗證結(jié)果顯示，有8對引物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生多態(tài)性。

圖4為PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物條帶情況概述。圖4A中1號引物（ND07）和3號引物（ND12）為可開展后續(xù)酶切驗證的引物；2號引物（ND08）擴(kuò)增出多條條帶，故舍去；4號引物（ND13）無清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，故舍去。圖4B中1號引物（ND06）可穩(wěn)定擴(kuò)增，2號引物（ND16）顯性親本無條帶，故舍去。

圖4 部分dCAPS標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR products by dCAPS molecular markers

由于dCAPS標(biāo)記中酶切位點一般包含于上游引物中，酶切產(chǎn)物即部分PCR產(chǎn)物被酶切得來，所以多態(tài)性差異較小，長度僅為20 bp。因酶切產(chǎn)物片段過于短小，在瓊脂糖凝膠電泳中跑出凝膠區(qū)域，共顯性酶切產(chǎn)物標(biāo)記中一般僅存在2個條帶片段，如圖5所示。

圖5 Sty I酶切產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.5 Sty I digested product

酶切篩選后8對dCAPS引物為：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16和DC19，轉(zhuǎn)化效率為40%，可用于后續(xù)基因定位研究。

3 討論

傳統(tǒng)正向遺傳學(xué)（Forward genetics）基因定位方法一般是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，但存在定位區(qū)間較大、定位精確性低等缺陷，且正向遺傳學(xué)步驟過程繁瑣，耗時較長[24]。近年來，隨著第二代測序技術(shù)飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)逐漸成熟，測序成本降低，更多方便快捷的基因定位方法被開發(fā)。

SNP（Single nucleotide polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，是指基因中單個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換等突變，共有4種突變形式：C-T（G-A）、T-A（A-T）、C-G（G-C）、C-A（G-T），但第一種突變形式頻率最高，約占全部突變頻率67%[25]。理論上來說，將CAPS和dCAPS相結(jié)合，可檢測任意SNP位點[26]。但在SNP轉(zhuǎn)化dCAP標(biāo)記中，引物能否轉(zhuǎn)化成功是關(guān)鍵，引物中錯配堿基數(shù)以及錯配位置距離引物3'端遠(yuǎn)近，均決定dCAPS標(biāo)記開發(fā)能否成功。Neff等研究擬南芥探索試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)插入錯配堿基在3'端第二位或者距離第二位更遠(yuǎn)位置時，可成功將限制性酶切位點引入引物中[22]。在PCR擴(kuò)增時使用不同DNA聚合酶得到的PCR擴(kuò)增結(jié)果可能會不同[26]，PCR擴(kuò)增時選用的DNA聚合酶不應(yīng)具有校正功能，否則影響錯配堿基插入，無法擴(kuò)增PCR產(chǎn)物或者無法正常插入酶切位點。因本試驗所選取SNP位點前后堿基均不存在酶切位點，無法直接設(shè)計得到CAPS引物，所以采用dCAPS標(biāo)記方法篩選引物和優(yōu)化。但部分dCAPS引物錯配堿基距離3'端位置較近，可能導(dǎo)致部分PCR擴(kuò)增效果差。本試驗所選用DNA聚合酶為2×EsTaqMas?terMix酶，不具有高保真性，因此在DNA聚合時可保證順利擴(kuò)增及后續(xù)試驗。

Di等研究玉米dCAPS標(biāo)記開發(fā)檢測時利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法作酶切產(chǎn)物分離[27]。但聚丙烯酰胺凝膠相較于瓊脂糖凝膠電泳而言，不僅制作過程復(fù)雜，且耗時久，故不推薦使用?？墒褂酶叻直媛虱傊悄z檢測酶切產(chǎn)物，Shahinnia等大麥dCAPS標(biāo)記開發(fā)中利用高分辨率Metaphor瓊脂糖凝膠[28]；Yanagisawa等在小麥dCAPS分子標(biāo)記中則利用另一種高分辨率Nusieve GTG瓊脂糖凝膠[19]。與本試驗所用普通瓊脂糖凝膠相比，高分辨率瓊脂糖雖效果較好，但價格過于昂貴，標(biāo)記開發(fā)成本升高。

本試驗所建立SNP/dCAPS轉(zhuǎn)化體系基因定位方法在甘藍(lán)作物中鮮有記載，本研究增加普通瓊脂糖凝膠電泳濃度，利用降低電泳電壓，延長電泳時間方法對差異較小酶切產(chǎn)物分離片段，達(dá)到經(jīng)濟(jì)實惠、操作簡單且有效的目的。

4 結(jié)論

本試驗根據(jù)野生型結(jié)球甘藍(lán)98-1030和突變型98-1030的基因組重測序數(shù)據(jù)所得的非同義SNP位點作為基礎(chǔ)，設(shè)計20對dCAPS引物，利用雙親及F1代作引物篩選及優(yōu)化，最終篩選出8對PCR產(chǎn)物清晰、酶切后可產(chǎn)生特異性片段的共顯性dCAPS標(biāo)記：DC03、DC04、DC06、DC07、DC11、DC12、DC16、DC19，標(biāo)記轉(zhuǎn)化率為40%。研究結(jié)果可為后續(xù)基因定位及結(jié)球甘藍(lán)優(yōu)良品種選育奠定理論基礎(chǔ)。