殷全玉， 李想， 王典， 張明月， 王兆雙， 云菲， 王新發(fā)， 劉國順

(1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州，450002；2.河南省煙草公司許昌市公司，河南 許昌 461099；3.許昌市煙草公司襄城縣分公司，許昌 襄縣 452670；4.河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司，河南 登封 452470)

過去的幾十年間，以氮素為主的無機肥料被大量施用到耕地上用來提高作物產(chǎn)量[1]，但是氮肥的過量施用并不總是能增加作物產(chǎn)量，甚至還會導致低的養(yǎng)分利用效率，土壤質(zhì)量下降和環(huán)境惡化[2]。發(fā)展集約化農(nóng)業(yè)的重大挑戰(zhàn)是維持土地生產(chǎn)力和阻止土壤退化[3]。目前好的解決措施是在減少化肥施用的同時投入一定量的有機物料來減輕化肥的負面影響，同時增加作物產(chǎn)量和土壤養(yǎng)分[4]。有機物料雖然可以提高土壤養(yǎng)分，但其長期效應大多較差，這是因為大多數(shù)的有機化合物會被礦化，只有少量低活性的物質(zhì)會留存在土壤中[5]。生物炭是生物質(zhì)資源在高溫貧氧條件下熱解制成的富碳產(chǎn)物，和傳統(tǒng)的木炭不同，生物炭的環(huán)境定位是專門應用于土壤的生態(tài)調(diào)理劑[6]。由于可以促進環(huán)境碳固存，還可以提高作物產(chǎn)量和減少肥料的使用，因此生物炭被認為是應對全球環(huán)境挑戰(zhàn)的“雙贏”方案[7]。生物炭中的碳以惰性碳為主，不易被微生物降解，可以在土壤中穩(wěn)定存在數(shù)百年[8]。

土壤微生物在養(yǎng)分循環(huán)轉化、生物防治、碳庫穩(wěn)定和團聚體的形成等方面發(fā)揮重要作用[9]。越來越多的研究表明，較高的微生物多樣性可以增強生態(tài)系統(tǒng)和微生物功能的穩(wěn)定性[10-11]。生物炭疏松多孔的結構可為微生物的生長提供溫床，其中豐富的碳源、生長因子和礦質(zhì)營養(yǎng)有利于土壤微生物的生物量的增加[12]。細菌繁殖周期短，速度快，數(shù)量最多，能夠快速分解進入土壤的物質(zhì)，是土壤生物學性狀最佳反映者[13]。目前，國內(nèi)外學者做了大量關于生物炭施用后對土壤細菌群落結構影響的研究，HAN等[14]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)多年施用生物炭改變了棉田土壤細菌群落結構，同時改變了土壤中接近半數(shù)細菌種類的相對豐度，這可能有助于改善棉田連作下土壤微生物多樣性降低的問題。ZHANG等[15]指出生物炭的施入使土壤微生物的生物量和活性增加，并且在長期施用條件下微生物群落結構會不斷得到改善。IMPARATO等[16]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量生物炭的施入對土壤細菌群落的功能和結構多樣性都存在一定的影響，但這種影響持續(xù)時間非常短。本研究從連續(xù)4年施用生物炭的田間改良試驗中收集了土壤樣品，主要為了探明生物炭長期施用對土壤理化性質(zhì)的影響、研究生物炭長期施用對土壤微生物的影響以及土壤細菌群落結構與土壤環(huán)境因子的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

本試驗于2015—2018年在河南農(nóng)業(yè)大學許昌校區(qū)現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)科教園區(qū)進行，地理坐標為34°16′12″N，112°42′31″E，海拔(72.8±9.8) m，屬暖溫帶季風型氣候，年平均氣溫14.3 ℃，平均降水量640.9 mm，平均相對濕度為83%，無霜期217 d，日照時間2 104.4 h。土壤類型為褐土，質(zhì)地屬于砂壤土，基礎肥力見表1。供試生物炭由河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司提供；在350 ℃條件下連續(xù)炭化加工制成的花生殼生物炭，具體理化性質(zhì)如表2所示。供試煙草品種為K 326。

表2 供試生物炭理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of biochar tested

1.2 試驗設計

試驗共設置4個處理：不施生物炭和化肥的休耕處理(FL)；施用化肥(CK)；化肥+1.5 t·hm-2生物炭(B1.5)；化肥+15 t·hm-2生物炭(B15)。采用隨機區(qū)組試驗設計，每個處理設置5次重復。試驗用到的化肥分別是硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鉀，每個施肥處理的氮素用量是30 kg·hm-2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶3，根據(jù)當?shù)厥┓柿晳T，70%的化肥于整地后移栽前條施，30%的化肥于移栽時穴施。每年3月中旬將生物炭撒施入土壤中，然后用旋耕機將生物炭與0～20 cm耕作層攪拌混合。種植體系為一年一茬，4月下旬起壟條施化肥，5月初移栽，試驗持續(xù)4 a。試驗周圍設置保護行，除生物炭用量外其他試驗因素和管理措施均保持一致。

于2018 年8月中旬在每個試驗小區(qū)采用5點取樣法取采集土壤樣品。每個處理采集5個重復混合樣，共計20個樣品。首先將新鮮土樣過2 mm篩網(wǎng)去除作物殘體和碎石雜塊，而后分為3個部分：一部分直接測定土壤含水率；一部分裝入無菌離心管，用冰盒帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于提取土壤DNA和后續(xù)的生物信息學分析；另一份樣品在室內(nèi)晾干、過篩、分裝，用于土壤其他各種常規(guī)理化特性的測定。

土壤各種速效養(yǎng)分、pH值、含水率、容重的測量依據(jù)常規(guī)標準方法進行，總碳和總氮采用碳氮元素分析儀(Vario MAX CN，Elementar，德國)測定，有機碳采用TOC 分析儀(Vario TOC，Elementar，德國)測定，土壤團聚體采用干篩法和濕篩法分別測定了≥5 mm，2～5 mm，1～2 mm，0.5～1 mm，0.25～0.5 mm 和<0.25 mm等不同粒級的團聚體組成。并在此基礎上計算了>0.25 mm機械穩(wěn)定性團聚體(DR0.25)含量，水穩(wěn)定性團聚體(WR0.25)含量和團聚體平均質(zhì)量直徑(MWD，mm)。

1.4 土壤細菌群落結構的測定

1.4.1 土壤總DNA提取及PCR擴增 利用E.Z.N.A. Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA公司，美國)提取土壤樣品的基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000(Thermo Scientific 公司，美國)分光光度儀檢測提取的DNA含量和純度，檢測合格后，采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌總DNA的V4區(qū)進行擴增，PCR 反應體系30 μL：Phusion Master Mix(2×)，15 μL，引物(2 μmol·L-1)，3 μL，模板DNA(1 ng·μL-1)，10 μL ，H2O，2 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min；30 個循環(huán)包括(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s)；72 ℃延伸10 min。

1.4.2 建庫測序及序列處理 PCR擴增產(chǎn)物純化后，將所有重復樣品等比例混合，利用北京諾禾致源科技有限公司Illumina-MiSeq測序平臺完成測序，并對原始下機序列進行質(zhì)控。采用 USEARCH (version 7.1)軟件將所有序列進行操作分類單元(OTU)的劃分與聚類，在每組OTU中選擇豐度最高的序列作為該組OTU 的代表序列。所有代表序列采用 RDP Classifier 分別從門和屬水平上進行物種注釋(分類閾值>0.8)[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Mothur 軟件分別計算樣本 Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)及測序覆蓋度[18]。土壤理化指標，細菌群落 alpha多樣性及不同分類水平上物種相對豐度的差異采用SPSS 軟件Duncan’s多重比較進行單因素方差分析(P<0.05)。采用 SPSS 軟件分析環(huán)境因子與菌群相對豐度的Pearson相關系數(shù)。樣本間群落組成差異采用主成分分析(PCA)非度量多維尺度排序分析(NMDS)。環(huán)境因子對樣本間細菌群落結構差異的影響采用冗余排序分析(RDA)。PCA、NMDS和RDA的可視化采用R軟件(version 3.3.1)的“vegan”包繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤理化性質(zhì)的影響

由表3可知，與只施化肥相比，施用生物炭顯著提高了土壤pH值、含水率、有機質(zhì)、碳氮比(P<0.05)。土壤容重隨著生物炭用量的增加而顯著降低(P<0.05)。隨著生物炭用量的增加，土壤速效鉀先顯著升高(P<0.05)后降低。與只施化肥相比，施用生物炭處理的MWD顯著高于對照(P<0.05)，B1.5處理的DR0.25和WR0.25均顯著高于其他處理，B15處理的DR0.25和WR0.25與CK間無顯著性差異。相較于休耕處理，單施化肥與施用化肥+生物炭均可以顯著提升土壤含水率、容重、有機質(zhì)和團聚體指標(P<0.05)，對于pH值、碳氮比和速效鉀的影響不大。

表3 生物炭對土壤理化性質(zhì)的影響

土壤pH值和碳氮比呈顯著正相關(r=0.84，P<0.01)，均與土壤容重呈顯著負相關(r=-0.85，P<0.01；r=-0.79，P<0.01)(表4)，這與4種不同施肥制度下的土壤容重差異一致。土壤含水率與MWD及DR0.25呈顯著正相關(r=0.78，P<0.01；r=0.7，P<0.01)，與WR0.25之間沒有顯著相關性，含水率和團聚體指標(MWD、WR0.25和DR0.25)在4種施肥制度下表現(xiàn)出不同的模式，這與生物炭的施用有關。土壤有機質(zhì)與含水率和團聚體指標(MWD、DR0.25和WR0.25)呈顯著正相關(P<0.05)。土壤速效鉀與WR0.25呈顯著正相關(r=0.6，P<0.01)。

表4 土壤理化特性間的Pearson相關性分析結果Table 4 Pearson correlation analysis results of soil physical and chemical properties

測序樣本經(jīng)聚類劃分為5 050個OTU，歸類于46個門，52個綱，114個目，201個科，429個屬。所有樣本共得到1 398 630條有效序列，單樣本平均序列數(shù)為69 932條。按照97%的序列相似度對序列聚類，獲得的樣本平均OTU數(shù)目為4 063，B1.5處理OTU數(shù)目顯著高于其余處理(P<0.05)。Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)常用來評價細菌群落alpha多樣性。B1.5和B15處理的Chao1指數(shù)顯著高于FL和CK處理，B15處理的Shannon 指數(shù)顯著高于其余處理(P<0.05)。樣品測序覆蓋度為97.74%～98.86%，可以較好地反映樣品序列的真實情況，滿足后續(xù)的一系列分析(表5)。

表5 基于V4區(qū)的細菌群落測序數(shù)據(jù)和alpha多樣性Table 5 Based on bacterial community sequencing data and alpha diversity in V4 region

2.3 生物炭對土壤細菌群落結構的影響

2.3.1 生物炭對土壤細菌門水平上物種相對豐度的影響 物種注釋結果表明，各樣本中門水平上細菌菌群主要歸類為6個菌門：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，這些優(yōu)勢菌門在所有可注釋菌所占的比例分別為27.98%、21.73%、13.21%、11.4%、6.76%和6.13%，相對豐度總和占可注釋菌的比例為87.21%(圖1)。

圖1 所有樣本中細菌門水平上的物種相對豐度

不同優(yōu)勢菌門細菌相對豐度在4種不同的施肥方式間存在差異。變形菌門在FL處理中相對豐度較低，在CK處理中相對豐度較高，土壤中施用化肥和生物炭對變形菌門的相對豐度無明顯影響。施肥處理的酸桿菌門相對豐度顯著低于休耕處理(P<0.05)，只施化肥和化肥+生物炭處理的酸桿菌門差別不大。放線菌門和芽單胞菌門在施肥處理的相對豐度顯著低于FL處理(P<0.05)。擬桿菌門在CK和B1.5處理中相對豐度較高，B15處理和FL處理中較低。綠彎菌門在B15處理的相對豐度最高，在CK處理相對最低，F(xiàn)L和B1.5處理的相對豐度顯著高于CK(P<0.05)(圖2)。

注：誤差線為標準誤差，誤差線上的的不同字母表示不同處理之間的顯著性差異(P<0.05)。Note: The error line is the standard error, and the different letters on the error line indicate the significant difference between different treatments (P<0.05).圖2 不同處理組門水平上優(yōu)勢細菌相對豐度Fig.2 Relative abundance of dominant bacteria at phylum level in different treatment groups

2.3.2 生物炭對土壤細菌屬水平上物種相對豐度的影響 土壤細菌屬水平上的物種注釋結果顯示，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在不同處理的相對豐度最高，在4個處理的平均豐度為2.91%～5.28%(表6)。相對豐度大于1%的菌屬為細菌菌群里的優(yōu)勢菌屬。不同處理土壤中unidentified_Acidobacteria、芽孢桿菌屬(Bacillus)、Dongia的相對豐度差異不大。FL處理的優(yōu)勢菌屬相對豐度整體高于施肥處理。與CK相比，生物炭的施用對土壤中馬賽菌屬(Massilia)、 Bryobacter和Haliangium的相對豐度影響不大。隨著生物炭施用量的增加，黃桿菌屬(Flavisolibacter)和溶桿菌屬(Lysobacter)的相對豐度均表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。此外，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的相對豐度在生物炭施用量為15 t·hm-2時顯著增加(P<0.05)。

表6 不同處理屬水平上優(yōu)勢細菌相對豐度

2.3.3 細菌群落相似性排序分析 為比較不同處理間土壤細菌群落結構的差異，采用基于Weighted Unifrac 距離的主成分分析(PCA)和非度量多維尺度分析(NMDS)來解釋土壤細菌群落的beta多樣性(圖3)。PCA排序分析表明，施肥處理和休耕處理的土壤樣品細菌組成存在顯著差異，CK和B1.5處理的樣本點分布重合度較高，B15處理的樣本點分布和態(tài)勢與CK較為接近，表明隨著氮肥或生物炭向土壤中的添加，細菌群落呈現(xiàn)出顯著的變化，在施用化肥的基礎上添加少量生物炭(1.5 t·hm-2)，細菌群落未發(fā)生明顯的變化，施加大量的生物炭(15 t·hm-2)則會使細菌群落結構向休耕土壤的方向發(fā)展。NMDS排序分析也獲得了相似的結果。

圖3 基于Weighted Unifrac距離的土壤細菌群落結構分析

2.3.4 土壤細菌群落結構與環(huán)境因子的相關性 由圖4可知，RDA分析的前兩個排序軸的解釋率分別為74.74%和19.16%，所選的9個環(huán)境因子一共解釋了93.9%的排序特征值，對土壤細菌多樣性變化具有顯著影響。其中每個處理的樣本點相對地聚集在一起，F(xiàn)L和B15處理子樣本點相對組間距離較近，主要分布在RDA1負半軸方向上，CK和B1.5處理子樣本點分布的離散性更大，在RDA1正半軸方向上分布(圖4)。此外，Mantel 檢驗結果表明，細菌群落結構與土壤環(huán)境因子密切相關，其中DR0.25(r=0.610 1，P=0.004)、MWD(r=0.554 1，P=0.003)、AK(r=0.532 7，P=0.0351)、WR0.25(r=0.463 8，P=0.031 4)和SBD(r= 0.443 2，P=0.006)對細菌群落結構影響最大(表7)。

注：pH：pH值；C/N：碳氮比；SBD：容重；WC：含水率；MWD：平均質(zhì)量直徑；WR0.25：水穩(wěn)定性團聚體；DR0.25：機械穩(wěn)定性團聚體；OM：有機質(zhì)；AK：速效鉀。

表7 細菌群落組成與土壤環(huán)境因子之間相關性的Mantel檢驗

細菌優(yōu)勢屬和土壤理化性質(zhì)的相關分析顯示，溶桿菌屬(Lysobacter)與C/N顯著負相關(P<0.05)。Haliangium與SBD、WR0.25和DR0.25顯著負相關(P<0.05)。黃桿菌屬(Flavisolibacter)與C/N顯著正相關(P<0.05)，與含水率和平均重量直徑MWD顯著負相關(P<0.05)。Dongia與WR0.25顯著負相關(P<0.05)。節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)與pH顯著正相關(P<0.05)，與SBD顯著負相關(P<0.05)。unidentified_Acidobacteria與WR0.25顯著正相關(P<0.05)。鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)與SBD、含水率、WR0.25、DR0.25和有機質(zhì)均顯著負相關(P<0.05)(表8)。

表8 細菌優(yōu)勢屬相對豐度與土壤理化指標的相關性Table 8 Correlation between relative abundance of dominant bacterial genera and soil physical and chemical indexes

3 結論與討論

生物炭通過與土壤顆粒發(fā)生復雜的物理化學變化而實現(xiàn)對土壤養(yǎng)分的長期影響[19]，主要表現(xiàn)在土壤pH值、含水率、孔隙度和陽離子交換量(CEC)的改善與土壤肥力的提升[20-21]。生物炭的添加可以增加土壤總碳，并且對碳庫的固持能力可以維持3年以上[22]?？紤]到生物炭自身的含氮量極低，因此生物炭對土壤中有效氮的影響可以忽略不計。這里觀察到生物炭對土壤碳氮比的增強效應主要是通過增加含碳量實現(xiàn)的。盡管生物炭中的惰性碳在其碳庫固持量占了較大比重，但是在這一過程中微生物量碳也有增加[22]。本研究中生物炭的添加增加了土壤pH，這可能是生物炭大多呈堿性，且灰分含量較高，可以有效地降低土壤交換性H+含量[23]。土壤團聚體的特殊形態(tài)和層次結構是存儲和維持有機質(zhì)的良好載體[24]。大型團聚體是由土壤的富碳有機物形成的，大型團聚體塑造的過程也誘導形成了微型團聚體[25]。添加生物炭是增加有機質(zhì)的有效方式，微生物的降解會消耗有機物，生物炭的穩(wěn)定結構可以在一定程度上扭轉土壤有機質(zhì)的退化[3,26]。加入生物炭的土壤含有較多數(shù)量的穩(wěn)定團聚體，包括機械穩(wěn)定性團聚體(DR)和水穩(wěn)定性團聚體(WR)，這可能是原生質(zhì)體和細胞壁物質(zhì)會在生物炭的生產(chǎn)過程被徹底分解，增加了營養(yǎng)物質(zhì)的供給[27]。生物炭施入土壤后可以降低土壤容重，增強土壤孔隙通透性并改善微生態(tài)環(huán)境，這是由于生物炭是有低密度的顆粒物組成的[28]。

土壤微生態(tài)環(huán)境與微生物的生長關系密切，土壤水分，孔隙度和養(yǎng)分狀況都會對土壤細菌群落造成影響。生物炭能夠通過改變土壤的物理化學特性，從而影響土壤微生物群落結構和功能[34]。本研究發(fā)現(xiàn)各級土壤團聚體指標是影響細菌群落結構的重要環(huán)境因子，有研究發(fā)現(xiàn)，土壤含碳量的增加可以促進細菌多樣性，同時各級團聚體數(shù)量和比例均有明顯增加[35]，這和本研究的結果有相似之處。本研究發(fā)現(xiàn)生物炭對部分土壤細菌相對豐度的影響并未隨生物炭用量的增加而加強，說明生物炭影響細菌群落的生態(tài)過程較為復雜，還需更進一步研究。

綜上所述，生物炭添加到土壤中4年后改善了土壤理化特性，顯著提高了土壤含水率、有機質(zhì)含量和碳氮比，有效地增強土壤團聚體穩(wěn)定性。施用生物炭4 a后增加了土壤細菌豐富度，細菌群落結構明顯改變。土壤容重、速效鉀和團聚體指標是細菌群落結構變異的主導性因子。生物炭對于提升植煙土壤養(yǎng)分有效性和改良微生態(tài)具有明顯的效果。但是還需要深入研究生物炭對不同類型土壤生物學特性的影響，以期為生物炭的生態(tài)改良提供參考。