郝勇航，劉俊峰，劉璐函，王鑫盛，吳秋玲，賀恒旭，陳麗穎,2，楊霞,2,宋合強(qiáng)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002; 3.河北省涿州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北 保定 072750)

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)在自然界中包括空氣、動(dòng)物糞便、皮膚、鼻腔等處廣泛存在，可以污染大多數(shù)食品，尤其在肉類和肉制品中的污染最為嚴(yán)重，是引起人類和動(dòng)物感染及導(dǎo)致人類食源性疾患(food-borne illness)的主要病原菌之一[1-2]。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌感染引起的疾病僅次于大腸桿菌[3]。金黃色葡萄球菌極易感染動(dòng)物和人，可引起嘔吐、發(fā)熱、腹瀉，甚至能致膿毒癥、敗血癥等全身疾病，其致病力與腸毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)密切相關(guān)，而其在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的腸毒素能引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的食物中毒，因此該菌一直是重點(diǎn)監(jiān)管的食品病原菌[4-6]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)自從20世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在世界范圍內(nèi)迅速傳播，尤其是在生豬及其肉制品中的散播已經(jīng)成為普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由于MRSA的毒力較強(qiáng)，且能耐受多種抗菌藥物，因此臨床上由MRSA感染引起的疾病往往難以治療[7]。在中國(guó)，由于養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生條件不佳，作為條件致病微生物，金黃色葡萄球菌常常引起豬葡萄球菌病，影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展。同時(shí)，隨著抗生素的濫用和亂用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷產(chǎn)生，治療效果不佳，而給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。

本研究在陜西省和河北省部分地區(qū)屠宰場(chǎng)采集待宰生豬及其屠宰環(huán)節(jié)豬體和屠宰場(chǎng)內(nèi)部環(huán)境樣本，進(jìn)行了細(xì)菌分離與一系列鑒定，檢測(cè)了金黃色葡萄球菌與MRSA菌株的流行分布及毒力基因攜帶情況，以調(diào)查其在生豬養(yǎng)殖到屠宰等各個(gè)環(huán)節(jié)中污染與傳播規(guī)律，為其防控提供一定的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

以無(wú)菌操作，在不同時(shí)間點(diǎn)(2019-09-15和2019-12-15)從陜西省咸陽(yáng)屠宰場(chǎng)采樣2次，分別標(biāo)記為屠宰場(chǎng)1a和屠宰場(chǎng)1b；在河北省保定某屠宰場(chǎng)(2020-01-10)采樣1次，標(biāo)記為屠宰場(chǎng)2。3次共采集生豬鼻腔拭子、體表拭子及環(huán)境樣品745份，其中包括每次采集空氣樣5份，燙毛水樣10份。第一次在咸陽(yáng)屠宰場(chǎng)(1a)采集待宰鼻腔拭子、電麻鼻腔拭子、卸頭鼻腔拭子樣品各40份，劈半體表拭子、脫毛體表拭子、冷庫(kù)體表拭子各30份，共采集樣品225份；在屠宰場(chǎng)1a采樣后，為進(jìn)一步檢測(cè)環(huán)境樣品對(duì)試驗(yàn)的影響，在屠宰場(chǎng)1b和屠宰場(chǎng)2采集工人使用的刀具柄樣品各5份，麻電環(huán)節(jié)地面、下白臟地面及胴體冷卻間的地面各采集樣品10份。第二次從咸陽(yáng)屠宰場(chǎng)(1b)采集待宰鼻腔拭子、電麻鼻腔拭子、卸頭鼻腔拭子各40份樣品，劈半體表拭子、脫毛體表拭子、冷庫(kù)體表拭子各30份樣品，共采集樣品260份；在保定屠宰場(chǎng)2采集待宰鼻腔拭子、電麻鼻腔拭子、卸頭鼻腔拭子各40份樣品，劈半體表拭子、脫毛體表拭子和冷庫(kù)體表拭子各30份，共采集樣品260份。

1.2 增菌與細(xì)菌分離培養(yǎng)

樣品的預(yù)處理、增菌與常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)按照國(guó)家食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.10—2016[10]金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)程序和方法進(jìn)行，并適當(dāng)加以改進(jìn)。

1.2.1 預(yù)增菌 將采集的拭子樣品以及燙毛水池中的水樣取1 mL分別置于含有無(wú)菌BPW(緩沖蛋白胨水)的離心管中，與空氣樣(將10 mL的無(wú)菌BPW置于50 mL的EP管中，分別暴露于屠宰場(chǎng)不同區(qū)域采集空氣樣品)36 ℃， 160 r·min-1振搖培養(yǎng)15 h；對(duì)采集的鼻腔拭子置于含有無(wú)菌7.5%氯化鈉肉湯中，36 ℃ 160 r·min-1振搖培養(yǎng)20 h。

1.2.2 增菌 用上述置于含有無(wú)菌BPW(緩沖蛋白胨水)的離心管中的預(yù)增菌液1 mL，接種于5 mL的7.5%氯化鈉肉湯中，36 ℃ 160 r·min-1振搖培養(yǎng)20 h。

1.2.3 細(xì)菌分離 在無(wú)菌環(huán)境中用接種環(huán)蘸取7.5%氯化鈉肉湯的增菌液，畫(huà)線接種于Baird-Parker瓊脂平板預(yù)篩選，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑選可疑菌落進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)PCR鑒定的疑似菌使用金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，37 ℃培養(yǎng)24 h。將金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基篩選的菌體接種于BHI肉湯中活化后，畫(huà)線接種于MRSA顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。BPW、7.5%氯化鈉肉湯和Baird-Parker瓊脂均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基和MRSA顯色培養(yǎng)基均購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司。2×Rapid Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.3 引物的選擇與合成

以金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁形成相關(guān)基因femB作為靶基因(依據(jù)GenBank上公布的序列)設(shè)計(jì)引物及利用文獻(xiàn)報(bào)道的MRSA基因mecA引物[11]和16S rRNA基因通用引物[12]。引物均由上海生物工程有限公司合成。各引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)金黃色葡萄球菌femB、mecA及16S rRNA基因的PCR引物Table 1 PCR primers for detection of S.aureus femB, mecA and 16S rRNA genes

1.4 基于金黃色葡萄球菌femB和MRSA的mecA基因的PCR擴(kuò)增

模板DNA提取的具體操作步驟參考細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒的說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系，組分如下：2×Rapid Taq Master Mix為10 μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板2 μL，去離子水7 μL。按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55 ℃退火40s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.5 16S rRNA基因序列擴(kuò)增及序列測(cè)序與分析

選擇通用引物27F和1492R作為上、下游引物，建立了50 μL的反應(yīng)體系：引物27F和1492R各1 μL；2×Rapid Taq Master Mix為25 μL；模板DNA為2 μL；去離子水21 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，選擇30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存并設(shè)立陰性對(duì)照。可以選用27F和1492R作為測(cè)序引物，將16S rRNA基因擴(kuò)增的序列送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.6 金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因檢測(cè)

通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]的部分毒力基因?qū)Y選出的金葡菌進(jìn)行毒力基因篩選。毒力基因的引物及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)為20 μl的反應(yīng)體系：2×Rapid Taq Master Mix為10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，去離子水6 μL。按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。

表2 金黃色葡萄球菌10個(gè)毒力基因PCR擴(kuò)增引物 Table 2 PCR primers for 10 staphylococcal virulence genes

利用SPSS軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行F值檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的總體檢出情況

使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.10—2016的分離、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基篩選、PCR鑒定及16S rRNA基因檢測(cè)等方法篩選金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌femB基因部分PCR鑒定結(jié)果如圖1A所示。將測(cè)序所得的16S rRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站導(dǎo)入Blast程序，通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序再進(jìn)行同源性比對(duì)確定分離菌種屬關(guān)系，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1B所示。

從745份樣品中共分離鑒定出98株金黃色葡萄球菌菌株，陽(yáng)性率為13.2%(98/745)。其中屠宰場(chǎng)1a和屠宰場(chǎng)1b的樣本中金黃色葡萄球菌分離率分別為15.6%(35/225)和10.4%(27/260)，屠宰場(chǎng)2的樣本中金葡菌分離率為13.8%(36/260)，這顯示在不同批次、不同屠宰場(chǎng)樣本中的金黃色葡萄球菌的污染率比較接近(P>0.05)。

2.2 金黃色葡萄球菌在待宰生豬及不同屠宰環(huán)節(jié)樣本中分布情況

對(duì)待宰生豬和屠宰場(chǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)的金葡菌檢出情況如表3所示。從表3可以看出，豬鼻腔拭子樣本中金葡菌陽(yáng)性率最高，在待宰、麻電和卸頭環(huán)節(jié)中分別為23.3%、15.8%和22.5%，平均檢出率為20.5%，明顯高于體表拭子樣本(劈半10.0%、脫毛2.2%，冷庫(kù)4.4%；平均5.5%)(P<0.01)，這說(shuō)明，待宰生豬及宰后豬鼻腔為金黃色葡萄球菌主要污染部位。為了解屠宰場(chǎng)內(nèi)部環(huán)境及器具的金葡菌污染情況，在采樣中增加了環(huán)境樣品的采集(空氣、刀具柄、麻電環(huán)節(jié)地面、下白臟地面及胴體冷卻間地面)，結(jié)果在刀具柄樣本中檢測(cè)出3株金黃色葡萄球菌(3/15)，在麻電、下白臟及冷卻間地面樣本中檢測(cè)出5株金黃色葡萄球菌(5/60)，而在空氣樣本中也有金葡菌檢出(1/15)。這說(shuō)明，屠宰加工用具和車(chē)間環(huán)境中存在著金黃色葡萄球菌污染，尤其是在衛(wèi)生管理較差的屠宰場(chǎng)(屠宰場(chǎng)2)金黃色葡萄球菌的污染較為嚴(yán)重，其環(huán)境樣本的金葡菌陽(yáng)性率高達(dá)15.0%。這將對(duì)豬肉生產(chǎn)加工帶來(lái)致病菌二次污染的風(fēng)險(xiǎn)。

圖1 部分金黃色葡萄球菌分離株femB基因及16S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖 Fig.1 Electrophoresis of PCR products for femB and 16S rRNA genes of some staphylococcal isolates

表3 不同地區(qū)各屠宰環(huán)節(jié)及環(huán)境樣品中金葡菌的分離情況Table 3 Prevalence of S.aureus in various slaughtering stages and environmental samples%

基于mecA基因的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌篩查采用PCR方法。結(jié)果(表4)顯示，98個(gè)金黃色葡萄球菌分離株中有12個(gè)為MRSA菌株(12.2%)，其中除了1株來(lái)自屠宰場(chǎng)1b麻電鼻腔環(huán)節(jié)外，其余11株均來(lái)自屠宰場(chǎng)2，具體為包括下白臟地面2株、冷卻間地面1株、待宰生豬鼻腔2株、麻電鼻腔2株、卸頭鼻腔1株、劈半體表1株及冷庫(kù)體表1株。

針對(duì)10個(gè)腸毒素基因Seb、seg、sei、sek、sem、sen、seo、seq、ser、seu的結(jié)果(圖2)顯示，腸毒素基因的總體檢出率為10.6%(104/980)，其中以sem、sei、sen、seg、sek的檢出頻次較高，依次為19、15、15、14和14。在屠宰場(chǎng)1a(35株)、屠宰場(chǎng)1b(27株)和屠宰場(chǎng)2(36株)不同批次分離株中，攜帶腸毒素基因的菌株數(shù)分別為15、8和16，分別占所在批次的42.9%、29.6%和44.4%。從來(lái)源來(lái)看，待宰環(huán)節(jié)和屠宰不同環(huán)節(jié)的大部分金葡菌分離株攜帶腸毒素基因數(shù)均≤3個(gè)，但檢出率沒(méi)有明顯規(guī)律。腸毒素基因在MRSA菌株與非MRSA菌株中的檢出率分別為13.3%和10.2%，二者沒(méi)有明顯的相關(guān)性(P>0.05)；其中MRSA菌株中有4株攜帶有腸毒素基因(33.3%，4/12)。但值得注意的是，來(lái)自屠宰場(chǎng)2的2個(gè)MRSA菌株均攜帶≥5個(gè)腸毒素基因，這提示了毒力基因與MRSA菌株高致病性的關(guān)聯(lián)性。

注：縱坐標(biāo)代表腸毒素基因個(gè)數(shù)，橫坐標(biāo)代表不同屠宰場(chǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)；未標(biāo)記的表示未檢測(cè)出毒力基因。Note: The ordinate: number of enterotoxin genes; The abscissa: stages in 3 slaughter houses; Absent: no virulence gene detected.

表4 不同地區(qū)各個(gè)屠宰環(huán)節(jié)及其環(huán)境分離株中MRSA的分離情況Table 4 MRSA isolates in various slaughtering stages and environment samples in different regions %

3 討論

本研究表明，在屠宰場(chǎng)待宰生豬、屠宰胴體及環(huán)境等環(huán)節(jié)均存在金黃色葡萄球菌污染，而以待宰生豬的帶菌率最高；在不同地區(qū)、不同季節(jié)的樣本中金葡菌的陽(yáng)性率比較接近；在屠宰鏈中，該菌在脫毛后體表樣本中的檢出率有顯著下降，推測(cè)其原因可能是屠宰過(guò)程中的體表沖洗、脫毛和燎毛等環(huán)節(jié)清除或殺死了部分金葡菌，但卸頭鼻拭子中金葡菌檢出率與麻電環(huán)節(jié)相比并沒(méi)有明顯減少，說(shuō)明燙池水溫度并不足以殺滅鼻腔中的致病菌。從不同環(huán)節(jié)來(lái)看，待宰生豬鼻腔和宰后豬鼻腔拭子中金黃色葡萄球菌檢出率明顯高于其他環(huán)節(jié)，與張靜等[14]的研究數(shù)據(jù)相近，但明顯低于聶青等[15]的報(bào)道。本研究中的金葡菌總體檢出率(13.2%)低于谷立惠等[16]和HE等[17]的報(bào)道。造成上述差異的原因可能與樣本采集地域、季節(jié)、數(shù)量、生豬來(lái)源以及屠宰場(chǎng)衛(wèi)生狀況等有關(guān)。此外，本研究在屠宰場(chǎng)2的刀具柄和麻電、下白臟及冷卻間地面等樣本中均檢出了金葡菌，而且其6個(gè)分離株中有3個(gè)是MRSA菌株，這提示了極高的金葡菌環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。

mecA基因是編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的外來(lái)結(jié)構(gòu)基因，只存在于MRSA菌株中，因此可通過(guò)基于mecA基因的PCR檢測(cè)及MRSA顯色培養(yǎng)基篩選來(lái)進(jìn)行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株鑒定[18-19]。金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)是一類外源性超抗原，能激活產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致發(fā)熱、低血壓和休克[20-21]。本研究結(jié)果顯示，雖然金黃色葡萄球菌在不同場(chǎng)(批次)中的檢出率接近，但MRSA菌株的檢出率差異巨大。其他研究也表明不同農(nóng)場(chǎng)之間及不同地區(qū)MRSA陽(yáng)性率有顯著差異[22-23]。

MRSA菌株的腸毒素作為一類結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似的外毒素，在臨床中能夠引起腹瀉等癥狀，其在食品中不因加工而滅活，至今已發(fā)現(xiàn)幾十種葡萄球菌腸毒素及定位其基因。汪永祿等[24]對(duì)55株醫(yī)院臨床標(biāo)本分離的金黃色葡萄球菌中檢出40株腸毒素基因陽(yáng)性；曹虹等[25]對(duì)67株MRSA臨床分離株腸毒素基因檢測(cè), 陽(yáng)性率為100%。本研究中共檢測(cè)39株金黃色葡萄球菌攜帶腸毒素基因(39.8%)，高于張陽(yáng)等[13]報(bào)道養(yǎng)豬場(chǎng)菌株比例(11.8%)，也證實(shí)了腸毒素基因攜帶情況的差異與樣本、地域及環(huán)境等因素有一定的關(guān)系。特別值得注意的是，本研究分離的2個(gè)MRSA菌株中攜帶有≥5個(gè)腸毒素基因，提示了MRSA對(duì)于肉食品具有嚴(yán)重的安全風(fēng)險(xiǎn)。