陳靜，尤瑞國(guó)，劉慧敏，楊國(guó)慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

如何提高畜禽肉質(zhì)性狀是當(dāng)今全世界畜牧業(yè)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。肉色、嫩度、風(fēng)味、多汁性和系水力是肉質(zhì)的重要指標(biāo)，它們都與肌肉內(nèi)的脂肪(intramuscular fat,IMF)含量有密切的關(guān)系[1-2]。IMF含量豐富是高品質(zhì)肉質(zhì)的重要特征，提高IMF的沉積量，從而提高肉的品質(zhì)，對(duì)于增強(qiáng)中國(guó)畜牧業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要的實(shí)際意義。IMF分為肌內(nèi)脂肪和肌間脂肪[3]，二者的功能與特點(diǎn)相似但又存在區(qū)別，但對(duì)于改善肉品質(zhì)均有重要作用。提高IMF含量有遺傳學(xué)、營(yíng)養(yǎng)、腸道微生物等多種方法，而利用營(yíng)養(yǎng)學(xué)的方法增加畜禽的IMF含量是一種快速有效、簡(jiǎn)便易行的手段。天然飼料添加劑如沙棘葉黃酮[4]、甜菜堿[5]、谷氨酰胺[6]等已經(jīng)在生產(chǎn)中得到應(yīng)用，動(dòng)物的生產(chǎn)性能、肉品質(zhì)等顯著提高。

檸檬醛是一種有機(jī)物，屬于開鏈單萜分子。天然檸檬醛是順式檸檬醛和反式檸檬醛的混合物[7]，在山蒼子油中含量豐富，容易獲得且價(jià)格低廉，在自然狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定。檸檬醛具有濃郁香味，多用于食品調(diào)香劑和保鮮劑，具有抗真菌、抗氧化作用[8-10]。另外，檸檬醛還可用于動(dòng)物的飼料添加劑，主要發(fā)揮風(fēng)味劑[11]和防霉脫毒作用[12]，提高動(dòng)物食欲和抑制黃曲霉菌等致病菌的產(chǎn)毒能力。飼料中添加檸檬醛，可以影響牛、羊、魚等生長(zhǎng)性能、消化酶含量、產(chǎn)奶量和蛋白含量等相關(guān)指標(biāo)[13-15]，而檸檬醛在調(diào)控IMF沉積中的作用很少涉及。因此，為了探索檸檬醛對(duì)畜禽IMF沉積的影響，本試驗(yàn)以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，通過飼料添加的方法，研究檸檬醛對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、IMF沉積及其相關(guān)基因表達(dá)水平、脂肪酸代謝酶水平的影響，為其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用檸檬醛(順式+反式)，CAS:5392-40-5，規(guī)格：100 mL，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其外觀無色流動(dòng)液體，流散性好；純度≥97%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料

將40只5周齡體重(20±2)g的雄性昆明小白鼠(購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組20只，5只一籠。首先進(jìn)行7 d的動(dòng)物房環(huán)境適應(yīng)，然后進(jìn)行18 d的飼喂試驗(yàn)。在飼喂試驗(yàn)中，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中添加3.5%檸檬醛。試驗(yàn)飼料執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》(GB 14924.3—2010)配置。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)管理

每只小鼠進(jìn)行剪趾標(biāo)記。籠舍、用具和場(chǎng)地在試驗(yàn)前進(jìn)行徹底消毒，保持衛(wèi)生，濕度適宜，溫度控制在20～25 ℃，光暗周期12/12(光照時(shí)間為08:00—20:00)，每天定時(shí)飼喂，每2 d更換墊料，自由采食，乳頭式飲水器自由飲水，防疫和消毒均按規(guī)定程序進(jìn)行。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能 每3 d逐只稱量小鼠空腹體重并記錄，詳細(xì)記錄每天采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量。

1.4.2 樣品采集與IMF含量測(cè)定 飼喂結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，取股四頭肌用生理鹽水清洗后裝入10 mL凍存管，迅速浸入液氮中，保存在-80 ℃的超低溫冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。采用脂肪測(cè)定儀(海能SOX406)根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中脂肪的測(cè)定》(GB 5009.6—2016)檢測(cè)股四頭肌IMF含量。

1.4.3 股四頭肌中PPAR(α、γ)、A-FABP的表達(dá)水平測(cè)定 取肌肉組織樣品，加1 mL放射免疫分析RIPA蛋白裂解液，使用分散機(jī)(IKA公司T10basic ULTRA-TURRAX)研磨，冰上孵育30 min，12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，95 ℃煮沸10 min，采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(碧云天)法測(cè)定蛋白濃度。蛋白裂解液樣品經(jīng)12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)100 V電泳，100 V、90 min轉(zhuǎn)硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，置于4 ℃、20 r·min-1水平搖床，使用一抗PPAR(α、γ)、A-FABP及內(nèi)參β-actin(CST)進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，室溫孵育二抗2 h，ECL-star顯影液覆蓋NC膜，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 脂肪酸代謝限速酶的表達(dá)水平測(cè)定 取肌肉組織樣品，分散機(jī)研磨，使用RNAi Plus試劑盒(TaKaRa)按說明書提取總RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA的濃度，1%瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物參考NCBI中GenBank公布的基因序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，使用莫納熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)；擴(kuò)增(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s)，40個(gè)循環(huán)；溶解(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 60 ℃ 5 s)，反應(yīng)體系為SYBR Green qPCR Mix，10 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)，0.4 μL；cDNA，50 ng，補(bǔ)DEPC水至終體積20 μL。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers sequences of fluorescence-based quantitative real-time PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SD)表示，P>0.05 表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬醛對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

經(jīng)過7 d的動(dòng)物房環(huán)境適應(yīng)后，對(duì)小鼠進(jìn)行18 d的飼喂試驗(yàn)。從適應(yīng)期開始記錄小鼠每天的采食量，每3 d對(duì)所有小鼠分別稱重。結(jié)果表明(表2)，試驗(yàn)組小鼠的平均日增重顯著提高；試驗(yàn)組小鼠的平均日采食量也有提高但差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)組小鼠的生長(zhǎng)速率顯著高于對(duì)照組(圖1)。

表2 檸檬醛對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能和采食量的影響Table 2 Effects of citral on growth performance of mice

圖1 小鼠體重變化Fig.1 Weight changes of mice

2.2 檸檬醛對(duì)小鼠IMF含量的影響

飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采集所有小鼠的股四頭肌組織，索氏提取法測(cè)定脂肪含量后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌IMF含量顯著提高，即檸檬醛誘導(dǎo)小鼠脂肪沉積增加(圖2)。

圖2 股四頭肌IMF含量檢測(cè)結(jié)果 Fig.2 IMF content in quadriceps femoris

2.3 檸檬醛對(duì)PPAR(α、γ)、A-FABP表達(dá)水平的影響

提取小鼠股四頭肌組織RNA(圖3A)和總蛋白，以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)PPARα、PPARγ和A-FABP基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌PPARα、PPARγ、A-FABP的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05或0.01)(圖3B)；Western bloting方法檢測(cè)PPARα、PPARγ、A-FABP的蛋白表達(dá)水平，并對(duì)信號(hào)條帶進(jìn)行灰度分析，結(jié)果表明，PPARα、PPARγ和A-FABP蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(圖3C和D)。

A:股四頭肌組織總RNA電泳，1-6泳道為不同小鼠股四頭肌組織RNA。B:試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。C:Western blot檢測(cè)小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)蛋白的表達(dá)，(M:1、2為試驗(yàn)組小鼠；3、4為對(duì)照組小鼠)。D:試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠A-FABP、PPAR(α、γ)蛋白灰度分析結(jié)果。

以2.3反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以脂肪酸代謝酶基因引物進(jìn)行QPCR擴(kuò)增分析。結(jié)果表明(圖4)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌脂肪酸分解代謝酶基因CPT-1、ACOX1、AMPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，ACOX3、CD36的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 脂肪酸分解代謝關(guān)鍵酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative mRNA expression of key enzyme genes in fatty acid metabolism

2.5 檸檬醛對(duì)脂肪酸合成代謝酶表達(dá)的影響

同樣以2.4的方式，對(duì)小鼠脂肪酸合成代謝酶基因進(jìn)行QPCR分析發(fā)現(xiàn)(圖5),與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌FASN、ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，DGAT1、LACS的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；脂肪酸代謝酶基因的熔解曲線見圖6。

圖5 脂肪酸合成代謝酶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative mRNA expression of enzyme genes in fatty acid synthesis

A：從左至右依次為L(zhǎng)ACS、ACC、FASN熔解曲線；B：DGAT1、CPT-1、CD36；C：AMPK、ACOX(1、3)；D：β-actin。A：From left to right are the melting curves of LACS，ACC，F(xiàn)ASN; B:DGAT1，CPT-1，CD36; C:AMPK，ACOX(1，3);D: β-actin.

3 討論與結(jié)論

以往對(duì)檸檬醛性質(zhì)的研究多見于抗菌、驅(qū)蚊、驅(qū)(殺)蟲、抗氧化、保鮮、抗癌等方面，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響見于牛、羊和魚等。本研究發(fā)現(xiàn)，檸檬醛的飼料添加促進(jìn)了小鼠的生長(zhǎng)速度，與上述動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果相符，說明檸檬醛有較為廣泛的促生長(zhǎng)作用。

檸檬醛的飼料添加對(duì)動(dòng)物IMF含量的影響研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檸檬醛可顯著提高小鼠的IMF含量；在調(diào)控IMF的分子機(jī)制研究上，作者還檢測(cè)了A-FABP、PPARs基因，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平均有顯著的提高，支持IMF含量升高的結(jié)果。劉志成等[16]、劉瑞莉等[17]、張軍等[18]在豬、牛、鴨等動(dòng)物試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)A-FABP、PPARs基因與IMF含量呈顯著相關(guān)性。CHEN等[19]研究表明，IMF含量隨萊蕪黑豬的生長(zhǎng)不斷增加且H-FABP和A-FABP基因的表達(dá)也隨之增強(qiáng)，但只有A-FABP的mRNA水平與IMF的含量存在著顯著的函數(shù)關(guān)系。PPARs基因己被公認(rèn)在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化中起重要作用。DUVAL等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PPARα在肌肉組織中的高表達(dá)加速了線粒體中脂肪酸的氧化速率；PPARα同時(shí)調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(FATP)、脂肪酸轉(zhuǎn)位基因(FAT/CD36)的表達(dá)，增加細(xì)胞質(zhì)從血液中吸收脂肪酸的速率。LI等[21]研究表明，脂肪細(xì)胞的PPARγ基因的敲除導(dǎo)致小鼠進(jìn)行性脂肪營(yíng)養(yǎng)不良。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，檸檬醛可顯著提高IMF含量和PPARα、PPARγ基因的表達(dá)，參與脂肪氧化相關(guān)的PPARα表達(dá)量顯著升高，可能的原因是PPARα不僅具有增加細(xì)胞吸收脂肪酸的功能，還是參與調(diào)控脂肪沉積的重要中間因子，如影響A-FABP、FATP的表達(dá)與活性等。試驗(yàn)組A-FABP的表達(dá)水平顯著增加，提示促進(jìn)A-FABP等基因的表達(dá)是提高肉品質(zhì)的方法之一。本試驗(yàn)對(duì)小鼠的研究結(jié)果說明，檸檬醛可以提高動(dòng)物的IMF沉積，但是在畜禽中能否達(dá)到相同的結(jié)果還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來驗(yàn)證，同時(shí)有必要著重研究PPARα、PPARγ、A-FABP等表達(dá)水平的升高對(duì)畜禽IMF的影響，從分子水平探索提高IMF的新思路。

IMF沉積還受到脂肪酸代謝的影響，IMF含量取決于脂肪酸的合成、分解、轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積等，機(jī)體通過協(xié)調(diào)控制脂肪代謝酶的活性和基因表達(dá)來調(diào)節(jié)脂肪沉積。研究表明，F(xiàn)ASN是肌肉組織脂肪酸再生能力的主要限速酶。陳杰等[22]通過測(cè)定肥育期蘇太豬背長(zhǎng)肌相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ASN與HSL的mRNA比值與IMF含量之間存在顯著的正相關(guān)；ACC是脂肪酸合成的重要限速步驟,關(guān)系到甘油三酯(TG)的底物濃度[23]。本研究中檸檬醛提高了FASN和ACC基因的表達(dá)水平，促進(jìn)了小鼠的脂質(zhì)合成。CPT-1是參與脂肪酸β氧化的限速酶，負(fù)責(zé)將長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體；ACOX特異性地催化長(zhǎng)鏈脂肪酸β氧化，在鼠、豬、和魚等物種中與脂肪酸代謝和脂肪沉積密切相關(guān)[24-25]。本試驗(yàn)中CPT-1、ACOX表達(dá)量的降低表明檸檬醛顯著降低肌肉細(xì)胞線粒體中脂肪酸的β氧化速率，將其轉(zhuǎn)化脂肪儲(chǔ)存；AMPK可通過磷酸化ACC抑制其活性，研究顯示小鼠骨骼肌中的AMPK缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的脂肪沉積和胰島素抵抗[26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠脂肪酸合成代謝酶FASN、ACC的表達(dá)顯著上升而分解代謝酶CPT-1、ACOX1、AMPK顯著下降，提示IMF沉積的增加。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠日糧中添加3.5%的檸檬醛可顯著提高小鼠生長(zhǎng)性能、IMF含量及相關(guān)調(diào)控基因和脂肪酸合成代謝酶的表達(dá)水平，同時(shí)顯著降低脂肪酸分解代謝酶的表達(dá)水平，說明檸檬醛具有促進(jìn)生長(zhǎng)并提高動(dòng)物肉質(zhì)的潛力。