翟芬芬 王燕青 馮 楝 許林藝 江丹生 韓志毅 彭得倜 陳家碧 邢宇鋒△

1.深圳市福田區(qū)慢性病防治院 (廣東 深圳，518000) 2.深圳市中醫(yī)院肝病科 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院

隨著肥胖癥和代謝綜合征在全球的流行以及病毒性肝炎疫苗的普及，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為發(fā)達(dá)國(guó)家肝功能酶學(xué)異常和慢性肝病最常見(jiàn)的原因，NAFLD發(fā)病率明顯增加并且呈低齡化發(fā)展趨勢(shì)。NAFLD診斷依賴于組織學(xué)，需除外由酒精及其他明確肝損害因素，其疾病譜包括單純性脂肪性肝病、脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。目前NAFLD的治療方法以改變生活方式、減肥[2]、胰島素增敏劑及抗氧化劑[3]、保肝藥[4]和益生菌[5]為主。單一使用針對(duì)某一發(fā)病機(jī)制的藥物無(wú)法治愈NAFLD，急需研發(fā)安全有效的治療藥物。

中醫(yī)藥在NAFLD的防治中具有極大的優(yōu)勢(shì)。課題組童光東教授基于數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)“肝病傳脾”“肝病實(shí)脾”理論，從氣郁為肝病的主要病機(jī)出發(fā)，提出“氣郁—痰濕內(nèi)蘊(yùn)化熱—致瘀”為NAFLD的病理機(jī)制，創(chuàng)立疏肝消脂方治療NAFLD。在本研究中，擬觀察疏肝消脂方對(duì)NAFLD模型大鼠腸道菌群多樣性和豐度、腸道屏障功能和腸道脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響，研究其調(diào)節(jié)菌群失調(diào)、保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)載脂蛋白的作用途徑，并探討其防治NAFLD可能的機(jī)制，為中醫(yī)藥防治NAFLD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠40 只，雌雄各半，體重(120±20)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SYXK(粵)2013-0001]，實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)深圳市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物及試劑 疏肝消脂方：柴胡、枳實(shí)、桅子各10 g，炒白芍、白術(shù)各15 g，甘草5 g，茵陳、澤瀉、山楂、草決明、荷葉、海浮石各30 g，茯苓20 g等。本研究中藥采用免煎劑，由深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥有限公司提供。BSA(A7906，Sigma)；進(jìn)口脫脂奶粉(M203，Amresco)；蛋白分子量Marker(Invitrogen)；RIPA裂解液(普利萊，P1053)；蛋白酶抑制劑cocktail(11873580001，Roche)；BCA蛋白定量試劑盒(23227，Thermo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))；Western blot轉(zhuǎn)膜電泳儀系統(tǒng)(Amersham，BioSciences)；機(jī)械勻漿器(Fisher Scientific，125)；恒溫振蕩器(培英，9211K)；層析實(shí)驗(yàn)冷柜(北京博儀康儀器有限公司，YC-1)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將40只大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、高脂模型組、疏肝消脂方低劑量組和疏肝消脂方高劑量組。每組10只大鼠。

1.4.2 動(dòng)物造模及給藥 以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)正常組大鼠，其余三組以高脂飼料(膽固醇2%，膽酸鈉0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，豬油10%，基礎(chǔ)飼料82.3%)飼養(yǎng)，誘導(dǎo)高脂模型[6]，高脂飼料喂養(yǎng)8周后，隨機(jī)從每組中挑選5只大鼠做肝組織病理檢測(cè)，判斷動(dòng)物模型是否成功。疏肝消脂方低劑量組和高劑量組分別予20、40 g/(kg·d)劑量，給予正常組和模型組用等體積蒸餾水灌胃。取材前1天禁食不禁水，第2天腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，取小腸組織和新鮮糞便。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 各組大鼠腸道菌群豐度檢測(cè) 處死動(dòng)物前，每組取新鮮大鼠腸糞標(biāo)本，每組取5個(gè)標(biāo)本。利用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA V3、V3-V4和V6區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，對(duì)20個(gè)樣本的16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)在初始數(shù)據(jù)、OTU、物種豐度和群落結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行常規(guī)分析。

1.5.2 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin和SIgA蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠小腸組織中ZO-1、Occludin和SIgA蛋白表達(dá)情況。方法如下：取出固定于4%多聚甲醛溶液中的小腸組織，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片處理，切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫處理25 min，蒸餾水洗滌2次(5 min/次)，抗原熱修復(fù)15 min，PBS洗滌2次(5 min/次)。切片與ZO1、Occludin和SIgA抗體在室溫下孵育2 h，與Envision二抗(Abcam, Cambridge, UK)在37℃孵育30 min，PBS洗滌2次(5 min/次)，用新鮮配制的DAB液沖洗。用流水終止染色。進(jìn)一步與蘇木精染色4 min,水洗后,加入1%鹽酸乙醇，返藍(lán)后流水沖洗15 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，用中性膠密封,顯微鏡下觀察。

1.5.3 各組大鼠小腸組織apoB48蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)各組大鼠小腸組織apoB48蛋白表達(dá)情況。方法如下：每組隨機(jī)抽取5只大鼠，取小腸組織作為樣本，勻漿后取上清，測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)過(guò)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗孵育、發(fā)光、膠片顯影后，經(jīng)掃描儀掃描取圖。

2 結(jié)果

2.1 疏肝消脂方對(duì)大鼠腸道菌群的影響 對(duì)新鮮糞便標(biāo)本進(jìn)行腸道微生物檢測(cè)，并進(jìn)行PCA和聚類分析。結(jié)果表明(如圖1B所示)，模型組與正常組腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著性差異。高劑量組和低劑量組與正常組結(jié)構(gòu)相似。如圖1A、C所示，模型組腸道菌群中乳酸菌科、產(chǎn)堿桿菌科和卟啉單胞菌科的相對(duì)豐度顯著降低，而螺旋菌科、擬桿菌科、消化鏈球菌科和產(chǎn)堿桿菌的相對(duì)豐度顯著提高。疏肝消脂方處理后，大鼠螺旋菌科、擬桿菌科、弧菌科的相對(duì)豐度降低，卟啉單胞菌科的相對(duì)豐度顯著升高。

圖1 疏肝消脂方調(diào)節(jié)腸道微生物組成和多樣性情況圖 (A.多樣本物種分類圖；B.物種豐度分布Heatmap圖；C.PCoA分析圖)

2.2 疏肝消脂方對(duì)大鼠腸道黏膜屏障的影響 與正常組相比，模型組腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，SIgA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。高、低劑量組ZO-1、Occludin蛋白水平明顯高于模型組(P<0.05)，SIgA表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠腸道黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 各組大鼠小腸病理圖 (免疫組化染色，200×)

2.3 對(duì)腸道脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白apoB48蛋白的影響 與正常組相比，模型組apoB48蛋白表達(dá)水平顯著增加(0.493±0.040vs0.164±0.003，P<0.01)；與模型組相比，高劑量組apoB48蛋白水平明顯降低(0.186±0.005vs0.493±0.040，P<0.01)，低劑量組apoB48蛋白水平(0.464±0.012)未見(jiàn)明顯變化。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠小腸組織apoB48蛋白表達(dá)情況

3 討論

NAFLD病理主要表現(xiàn)為脂肪顆粒沉積于肝臟，肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，炎性細(xì)胞增多并浸潤(rùn)肝臟組織，是全身性代謝綜合征在肝臟組織中的表現(xiàn)。NAFLD雖為良性疾病，但它有可能發(fā)生肝臟纖維化，進(jìn)而發(fā)生肝硬化甚至肝癌。

腸道和肝臟在胚胎時(shí)期有共同的起源——前腸，腸道淋巴細(xì)胞起源于發(fā)育中的肝臟，這種組織的同源性決定了肝臟和腸道組織在生理病理過(guò)程中密切相關(guān)。門靜脈將兩個(gè)器官?gòu)慕馄蕦W(xué)上緊密聯(lián)系。在腸道屏障功能受損時(shí)，腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素大量進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)。內(nèi)毒素激活肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞)釋放一系列促炎細(xì)胞因子，炎癥介質(zhì)介導(dǎo)肝臟組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)NAFLD患者攝入過(guò)多脂質(zhì)，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)因此發(fā)生改變，內(nèi)毒素產(chǎn)生增加，加速肝臟內(nèi)甘油三酯的合成，失衡的腸道菌群降低分布于外周脂肪組織和肝臟細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性，脂肪酸氧化減少，脂代謝發(fā)生紊亂[7]。腸道菌群與血清炎癥因子水平顯著相關(guān)[8,9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)胃癌脾胃虛弱證患者舌苔卟啉單胞菌科與血清白介素-6水平呈負(fù)相關(guān)。調(diào)節(jié)腸道菌群已成為治療NAFLD的新靶點(diǎn)[11]。

apoB48的表達(dá)與高脂血癥密切相關(guān)，apoB48特異性表達(dá)于小腸上皮細(xì)胞，僅由小腸上皮細(xì)胞合成，是甘油三酯(TG)的載脂蛋白[12]。TG與apoB48 結(jié)合成乳糜微粒(CM)，通過(guò)淋巴循環(huán)進(jìn)入體內(nèi)。NAFLD 患者存在小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)(SIBO)和腸粘膜通透性改變現(xiàn)象。腸粘膜完整性的保持極大程度依賴于腸道上皮細(xì)胞之間的緊密連接。Occludin、claudin-1和ZO-1作為緊密連接的重要組成部分，組成腸道的機(jī)械屏障。這些蛋白可以特異性反映小腸組織緊密連接的完整性，可以通過(guò)控制緊密連接的通透性參與上皮屏障功能的調(diào)控[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者腸粘膜通透性增高，腸粘膜上皮緊密連接縮短，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1明顯表達(dá)減少[15]。因此從腸道菌群多樣性和豐度、腸道屏障功能和腸道脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能入手，開(kāi)展NAFLD脂質(zhì)過(guò)載誘發(fā)腸道微生態(tài)紊亂-腸粘膜屏障障礙-內(nèi)毒素異位-肝臟炎癥損傷機(jī)制研究具有重要意義。

前期研究證明，疏肝消脂方能改善NASH患者的臨床癥狀，降低非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠TG、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、血漿黏度值和AST水平[16]。同時(shí)，疏肝消脂方降低NASH大鼠肝組織TG、TC指數(shù)，上調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPARα)、下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂肪酸代謝，增加脂肪酸β氧化，從而減輕肝臟脂肪沉積程度[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，疏肝消脂方低、高劑量組大鼠微生物代謝相關(guān)菌群均顯著減少，小腸緊密連接變長(zhǎng)，腸粘膜通透性降低，提示疏肝消脂方能有效改善NAFLD大鼠腸道菌群失調(diào)，改善小腸機(jī)械屏障和免疫屏障。同時(shí)，不同劑量疏肝消脂方可明顯降低apoB48蛋白表達(dá)，這表明，疏肝消脂方可能通過(guò)下調(diào)apoB48蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)腸道菌群和小腸屏障功能，這可能是其治療NAFLD的機(jī)制之一，但還需進(jìn)一步探討。