射干與川射干的鑒別研究

鄧杰華，周云峰，鄧見(jiàn)春，李存金，黃炳泉，楊建冬

1.宜春市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 宜春 336000；2.高安市人民醫(yī)院，江西 高安 336000

射干（Belamcandae rhizome）為鳶尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根莖，具有清熱解毒、消痰、利咽、抗癌的功效，臨床主要用于咽喉腫痛、痰咳咳喘等癥狀［1-4］。射干臨床應(yīng)用廣泛，在全國(guó)范圍流通使用，需求量大，常有混淆品出現(xiàn)，其中典型的混淆品為川射干（Iridis tectori rhizoma），其為鳶尾科植物鳶尾Iris tectorumMaxim.的干燥根莖［5］，主要在重慶、四川等地使用，兩者外形相似，功能相似，容易混淆［6-8］。為了有效對(duì)射干和川射干進(jìn)行區(qū)分，本研究從性狀、薄層色譜、次野鳶尾黃素含量及指紋圖譜等方面對(duì)二者進(jìn)行比較，為射干的質(zhì)量控制及合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），DAD 檢測(cè)器；Waters E2695 2998 高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），PDA 檢測(cè)器；超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司）；萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；十萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 材料與試劑

射干對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，120994-201206）、次野鳶尾黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111557-200602）、射干苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，111632-200602）；射干飲片分別收集于江西省部分縣市批發(fā)企業(yè)、藥店、醫(yī)療機(jī)構(gòu)等（表1），經(jīng)鑒定9 批為射干，6 批為混淆品川射干；甲醇、乙腈均為色譜純（Sigma aldrich公司），磷酸為色譜純（天津福晨化學(xué)試劑廠），純化水（摩爾一級(jí)水），其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

射干飲片外表皮為黃褐色、棕褐色或黑褐色，川射干外表皮為灰黃褐色或棕色，以顏色來(lái)區(qū)分，差異并不明顯，而以切面特征進(jìn)行比較，可快速鑒別兩者。射干飲片的切面呈淡黃色或鮮黃色，具散在筋脈小點(diǎn)或筋脈紋，有的可見(jiàn)環(huán)紋，而川射干的切面呈黃白色或黃棕色，無(wú)筋脈小點(diǎn)或筋脈紋。

2.2 薄層色譜［3］

參照《中國(guó)藥典》2015 年版一部射干薄層色譜方法，噴以顯色劑后105 ℃加熱5 min，置紫外燈下（365 nm）檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1。S1、S2、S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14 為射干飲片，與對(duì)照藥材相比，各斑點(diǎn)位置、顏色、及亮度等均較一致；S3*、S6*、S9*、S11*、S13*、S15*為川射干，與射干及射干對(duì)照藥材相比，均多出現(xiàn)一個(gè)明顯的黃色斑點(diǎn)，可較好地與射干區(qū)分。

圖1 薄層色譜圖

2.3 含量測(cè)定［3］

按照《中國(guó)藥典》2015 年版一部射干含量測(cè)定方法。采用高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Diamonsil C18，250×4.6 mm×5 μm），以甲醇-0.2%磷酸溶液（53∶47）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm，外標(biāo)法測(cè)定樣品中次野鳶尾黃素含量。

結(jié)果表明，15 批樣品中9 批次正品射干飲片次野鳶尾黃素含量為0.11%～0.16%，均值為0.14%，符合《中國(guó)藥典》2015 年及2020 年版對(duì)射干中次野鳶尾黃素含量的規(guī)定（不得少于0.10%）；6 批次混淆品川射干飲片次野鳶尾黃素含量為0.08%～0.11%，均值為0.09%，其中有兩批川射干達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)），射干與川射干的次野鳶尾黃素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。樣品與對(duì)照品的色譜圖和紫外吸收掃描圖見(jiàn)圖2、圖 3，15 批樣品的次野鳶尾黃素含量見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

圖2 色譜圖：A.次野鳶尾黃素；B.射干；C.川射干

圖3 紫外吸收掃描圖：a.次野鳶尾黃素；b.射干；c.川射干

2.4 指紋圖譜

2.4.1色譜條件色譜柱：Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min 10%A，15～30 min 10%→20%A，30～50 min 20%→40%A，50～58 min 40%→50%A，58～80 min 50%→70%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為296 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2溶液的制備稱取15 批樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）各約1 g，分別置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇適量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密稱取次野鳶尾黃素和射干苷，加70%甲醇制成1 mL 分別含次野鳶尾黃素9.57 μg、射干苷20.24 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3方法學(xué)考察精密度實(shí)驗(yàn)：取一份樣品（S1），以“2.4.2”方法處理制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄色譜圖；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取編號(hào)為S1 的樣品，平行制備6 份供試品溶液，依次進(jìn)樣，記錄色譜圖；取一份供試品溶液（S1），分別在0、2、6、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以16 號(hào)峰（次野鳶尾黃素）保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得其余26 個(gè)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于1.28%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.85%，表明該方法具有可行性。

2.4.4HPLC 指紋圖譜指紋圖譜的建立及共有峰的確定采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.130723 版”軟件對(duì)9 批射干的指紋圖譜（圖4）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S14 樣品的各相應(yīng)峰的峰面積響應(yīng)值較大，以S14 樣品的指紋圖譜設(shè)置為參考譜圖，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.1，以中位數(shù)法經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正和譜峰匹配后，得到射干對(duì)照指紋圖譜（圖5），并標(biāo)定了27 個(gè)共有指紋峰，其中11 號(hào)峰為射干苷，16 號(hào)峰為次野鳶尾黃素，射干的定量成分為次野鳶尾黃素，以16 號(hào)峰為參照峰。將對(duì)照指紋圖譜的相似度值默認(rèn)為1，計(jì)算9 批射干指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，9 批射干之間的相似度在0.971～1.000（>0.90），相似度評(píng)價(jià)結(jié)果較好。

圖4 射干指紋圖譜

圖5 射干對(duì)照?qǐng)D譜

2.4.5混淆品川射干HPLC 指紋圖譜的差異性比較6批川射干與射干的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行峰匹配，選取25 個(gè)共有指紋峰，其中9 號(hào)峰為射干苷，16 號(hào)峰為次野鳶尾黃素，并對(duì)6 批混淆品川射干與射干對(duì)照指紋圖譜相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，6 批川射干之間的相似度在0.990～1.000（>0.90）之間，相似度較好，而與射干對(duì)照指紋圖譜比較，相似度計(jì)算結(jié)果在0.582～0.627（<0.90）之間，相似度較差，可以看出，射干與川射干雖然有許多相同的化學(xué)成分［9-11］，但在整體上兩者的化學(xué)成分還是具有一定的差異性。

圖6 川射干指紋圖譜

圖7 川射干對(duì)照?qǐng)D譜

2.4.6聚類分析從15 批樣品指紋圖譜中選取峰面積總和占總峰面積80%以上的共有峰，確定9 個(gè)，以這9 個(gè)共有峰的峰面積為特征，得到15×9 階原始數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用SPSS 23.0 分析軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析，采用Ward 法，以歐式平方距離為測(cè)度，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分組（圖8）。結(jié)果表明，15 批樣品可分為兩類，其中1、2、4、5、7、8、10、12、14 號(hào)歸為一類（射干），3、6、9、11、13、15 號(hào)歸為另一類（川射干），與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果完全吻合。

圖8 15批樣品聚類分析圖（Ward法）

3 討論

本文結(jié)合性狀鑒別、薄層色譜、含量測(cè)定和指紋圖譜四個(gè)方面對(duì)射干和川射干進(jìn)行了鑒別比較。射干與川射干從外觀性狀上看切面顏色及特征有明顯區(qū)別，薄層色譜存在不一致的主斑點(diǎn)，可將二者鑒別開。指紋圖譜能較全面的反映中藥材及飲片中各種化學(xué)成分的分布情況，對(duì)不同品種進(jìn)行定性分析［12-15］。本研究建立的指紋圖譜評(píng)價(jià)方法，能夠很好地對(duì)射干同品種、川射干同品種進(jìn)行聚類，各自的相似度均較高，且射干與川射干二者的相似度較差（<0.65），分析主要是因?yàn)? 號(hào)峰、10 號(hào)峰、11 號(hào)峰（射干苷）、12 號(hào)峰、17 號(hào)峰、18 號(hào)峰、19 號(hào)峰、20 號(hào)峰峰面積差異較大，這8 個(gè)色譜峰可作為判別射干與川射干的特征峰，另結(jié)合聚類分析結(jié)果，能較好地反映射干與混淆品川射干的差異。次野鳶尾黃素含量二者總體有顯著性差異，但部分川射干中含量與射干接近，能達(dá)到藥典中射干飲片的規(guī)定，此項(xiàng)不適合作為二者的區(qū)別點(diǎn)。

從研究結(jié)果看，射干薄層色譜圖顯示的部分斑點(diǎn)顏色、位置與川射干均一致，指紋圖譜顯示二者有較多共有峰，分析主要是因?yàn)槎呔鶃?lái)源于鳶尾科，成分有相似之處。

市售射干存在較多與川射干混用的現(xiàn)象，雖兩味中藥在性味、歸經(jīng)、應(yīng)用上較相似，但《中國(guó)藥典》一部明確規(guī)定其為兩個(gè)完全不同的品種，且綜合此次研究結(jié)果看，二者成分存在差異，導(dǎo)致其藥理作用可能會(huì)有區(qū)別，臨床使用中應(yīng)注意區(qū)分，避免混淆使用。