施鳳超，朱文峰，朱宇偉，王 成，周 敦

（鹽城市第三人民醫(yī)院/南通大學第六附屬醫(yī)院骨科，江蘇 224001）

類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性炎癥性自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為滑膜炎、關(guān)節(jié)病、骨損害及全身并發(fā)癥[1]。目前關(guān)于RA致病因素和病理機制仍未完全明確,臨床上治療可減輕患者癥狀,延緩病變進展,但不能根治。RA病理改變主要包括慢性滑膜炎癥、滑膜增生和炎性細胞浸潤,炎性細胞因子促進全身或局部炎癥過程,增加基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生和釋放,導致細胞外基質(zhì)降解和骨侵蝕[2]。持續(xù)過量的炎性細胞因子導致慢性炎癥和類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[3]。有研究顯示,HMGB1/TLR/NF-κB途徑在RA發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[4-5]。雙氯芬酸鈉(diclofenace sodium,DS)為經(jīng)典的非甾體類抗炎藥,通過抑制花生四烯酸環(huán)氧酶系統(tǒng),導致前列腺素生成減少,具有消炎、鎮(zhèn)痛的作用,可用于緩解關(guān)節(jié)炎患者的病情,但長期應用易產(chǎn)生不良反應,尤其是胃腸道,因此尋找有效、安全的藥物有重要意義。木樨草素(luteolin,Lu)是食物中常見的類黃酮,具有自由基清除、抗癌和抗炎活性等多種藥理作用[6-9]。本研究通過弗氏佐劑誘導大鼠關(guān)節(jié)炎模型,探討木樨草素對關(guān)節(jié)炎的改善作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 雄性SD大鼠50只,8周齡,體重200～250 g[中國南京江寧青龍山動物養(yǎng)殖場提供,SCXK(蘇)02016-0010]。木樨草素(國家食品和藥物管制研究所,純度97%,批號20192011)。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)。所有抗體均購自CST公司。

1.2 實驗動物分組50只大鼠隨機分為正常對照組、弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)組、DS組、Lu 20組和Lu 40組,每組10只。除正常對照組外,其余各組大鼠于第0天在左后足背注射0.1 mL弗氏完全佐劑(FCA),建立關(guān)節(jié)炎模型。實驗第21～28天每日DS組大鼠口服雙氯芬酸鈉5 mg/kg,Lu 20組和Lu 40組分別口服木樨草素20 mg/kg和40 mg/kg,正常對照組和AA組口服等量生理鹽水。

1.3 左后足體積測量 注射弗氏佐劑后,每7天采用排水法檢測大鼠左后足踝關(guān)節(jié)體積(HPV),測量3次,取平均值,以評估腫脹程度[10]。

1.4 細胞因子測定 實驗第29天以3 %水合氯醛麻醉大鼠,頸動脈采血,離心取血清。然后處死大鼠,取下踝關(guān)節(jié)標本。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清和踝關(guān)節(jié)滑膜液中IL-6、IL-1β及TNF-α水平,嚴格按照試劑盒說明書操作,在分光光度計450 nm處讀取吸光度。

1.5 組織病理學檢查 取踝關(guān)節(jié)滑膜標本,以10%中性福爾馬林固定24 h,石蠟包埋,5μm厚切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察細胞浸潤、血管翳形成和水腫程度等病理變化。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析 取關(guān)節(jié)滑膜組織,在含0.1%苯基甲磺酰氟的冷RIPA緩沖液中勻漿,12 000 rpm離心20 min,收集上清液,采用BCA法測定其蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)提取物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,以5%脫脂乳在tris緩沖液中封閉,然后加入相應的一抗,在4℃下孵育過夜。tris緩沖液-吐溫20(TBST)洗滌后,加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(1∶10 000),室溫下孵育1 h。采用增強化學發(fā)光法(ECL)檢測,通過圖像分析軟件(Bio-Rad實驗室)進行定量。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示,組間差異性比較采用方差分析和圖基多重比較檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠左后足腫脹程度的影響 實驗開始時,各組間大鼠左后足HPV比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AA組注射弗氏佐劑后第7、14、21天左后足HPV進行性升高,與正常對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。注射佐劑后第28天Lu 20組、Lu 40組及DS組大鼠左后足HPV明顯減小,與AA組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),但Lu 20組、Lu 40組、DS組3組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠腳腫脹體積的影響

2.2 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜液中細胞因子水平的影響 與正常對照組相比,AA組大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Lu 20組、Lu 40組及DS組大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯低于AA組,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而Lu 20組、Lu 40組、DS組3組間比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠血清（A）及滑膜液（B）中細胞因子水平的影響

2.3 組織病理學檢查結(jié)果 正常對照組大鼠踝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)正常,AA大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的滑膜水腫、炎性細胞浸潤、上皮變性和關(guān)節(jié)軟骨糜爛。與AA組相比,Lu 20組、Lu 40組及DS組大鼠關(guān)節(jié)滑膜水腫、炎性細胞浸潤、上皮變性及關(guān)節(jié)軟骨糜爛明顯減輕。Lu 20組、Lu 40組、DS組病理改變無明顯差異。見圖3。

圖3 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織病理改變的影響

2.4 木樨草素對關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR/NF-κB信號蛋白表達的影響 蛋白印跡檢測顯示,與正常對照組比較,AA組大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65(P-P65)和p-IκBα蛋白表達水平顯著上調(diào);與AA組比較,Lu 20組、Lu 40組及DS組大鼠滑膜組織中上述蛋白水平均明顯下調(diào),而Lu 20組、Lu 40組、DS組之間無明顯差異。見圖4。

A：正常對照組;B：AA組;C：DS組;D：Lu 20組;E：Lu 40組。

3 討 論

弗氏完全佐劑FCA是廣泛使用的關(guān)節(jié)炎誘導工具,可以模擬人類關(guān)節(jié)炎組織學和臨床特征,如關(guān)節(jié)腫脹、滑膜增生和軟骨或骨降解[11]。完全佐劑暴露在皮下會導致動物爪子和腳踝出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎,后爪體積是評價炎癥程度和藥效的主要指標。佐劑刺激后,大鼠體內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和細胞因子,刺激血管翳形成、滑膜增生和骨破壞加速關(guān)節(jié)炎形成。TNF-α刺激先天免疫級聯(lián)反應,并模擬其他炎癥細胞因子的分泌[12]。IL-1是關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨破壞和滑膜細胞自我增殖的重要因素[12-13]。IL-6是類風濕性關(guān)節(jié)炎滑膜中高度表達的細胞因子,可導致關(guān)節(jié)損傷[14-15]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),木樨草素與DS均可以顯著改善佐劑誘導的大鼠關(guān)節(jié)腫脹,降低大鼠血清及滑膜液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平,兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

許多文獻報道HMGB1通路在關(guān)節(jié)炎中的重要作用[16-18]。已證實HMGB1信號通路介導的NF-κB在類風濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮作用[19]。NF-κB是調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6和TNF-α產(chǎn)生的重要分子[20]。在正常細胞中,失活的NF-κB被細胞質(zhì)中的核因子κB蛋白捕獲。IKK復合物含有IKKα和IKKβ,是調(diào)節(jié)IκB的主要物質(zhì)[21]。在IκB磷酸化和降解后,NF-κB立即轉(zhuǎn)移到細胞核,并促進細胞因子和炎癥介質(zhì)的表達[22]。為了探討木樨草素作用的分子機制,本研究采用蛋白質(zhì)印跡檢測,結(jié)果顯示,木樨草素與DS一樣,能顯著抑制關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織HMGB1、TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65(P-P65)和p-IκBα蛋白表達,提示木樨草素對弗氏完全佐劑性關(guān)節(jié)炎的保護作用可能與抑制HMGB1/TLR/NF-κB信號通路有關(guān)。