周國燕，陳魯喜，孫 艷，萬 杰，陳 彬，張 濤＊，安拉扎，仇劍宇

1 涼山彝族自治州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川西昌 615000

2 涼山科華奶牛繁育有限公司，四川西昌 615042

3 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安 625000

0 引言

乳房炎是困擾奶牛養(yǎng)殖場最常見且最具挑戰(zhàn)性的疾病之一[1]，幾乎所有奶牛場均有發(fā)病史。因奶牛的乳腺具有特殊結(jié)構(gòu)，其在受到物理、化學(xué)、微生物等刺激時(shí)容易產(chǎn)生炎性變化而發(fā)生臨床型乳房炎或隱性乳房炎，不僅使產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)降低，還會(huì)引起奶牛產(chǎn)后發(fā)情周期延遲、生殖機(jī)能受損、生產(chǎn)性能降低，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，并且乳房炎感染的某些病原菌還嚴(yán)重威脅人類健康[2]。相關(guān)研究顯示，全球2.2 億頭奶牛中約1/3患有不同程度的乳房炎疾病，造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)30 億美元，我國每年約花費(fèi)2080 萬美元用于奶牛乳房炎的防控[3]。據(jù)項(xiàng)目組調(diào)查，四川涼山地區(qū)奶牛乳房炎每月最高隱性發(fā)病率高達(dá)70.0%，月最高臨床發(fā)病率達(dá)15.3%，遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)2.0%的臨床發(fā)病率，嚴(yán)重影響本地區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。在奶牛場中，乳房炎不僅發(fā)病率高，而且已知病原菌感染種類多達(dá)百余種[4]，并且病原菌在牛群、地區(qū)存在區(qū)系分布差異，病原菌流行株不盡相同，不同地區(qū)細(xì)菌分離率也不同。受生產(chǎn)管理、獸醫(yī)技術(shù)水平、抗生素用藥規(guī)范程度等影響，長期乳房炎抗生素治療使不同地區(qū)菌群藥物敏感性發(fā)生較大的差異[5]。

為了掌握本地區(qū)乳房炎病原菌流行情況及耐藥情況，項(xiàng)目對涼山地區(qū)乳房炎牛只進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，并測定病菌的藥物敏感特性，篩選出敏感的抗菌藥物，為涼山地區(qū)奶牛乳房炎的有效防治提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)為開展奶牛乳房炎進(jìn)一步治療以及耐藥基因、耐藥原因的研究奠定基礎(chǔ)[6，7]。

1 材料

1.1 樣品及質(zhì)控菌株

2020年9月至2021年2月期間，在涼山州奶牛主要養(yǎng)殖區(qū)的不同規(guī)模養(yǎng)殖場采集臨床型和CMT隱性乳房炎樣本（＋＋以上），共193 例奶牛乳汁作為試驗(yàn)樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATTCC25923由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院新獸藥安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 培養(yǎng)基

LB肉湯、高鹽肉湯培養(yǎng)基、SC肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯、乙基紫肉湯培養(yǎng)基、MHB肉湯培養(yǎng)基、高鹽-甘露醇瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.2 抗菌藥物

阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻呋、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、克林霉素、氟苯尼考、紅霉素、青霉素。

1.2.3 其他試劑

紅四氮唑（TTC）、革蘭氏染液套裝、0.5麥?zhǔn)媳葷峁?、丙三醇、氯化鈉、腸桿菌科生化鑒定管（11 種）、葡萄球菌屬生化鑒定管（16 種）、鏈球菌屬生化鑒定管（11 種）、綠膿桿菌生化鑒定盒（5 種）、細(xì)菌16S rDNA的通用引物。

1.2.4 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50FBS）、微量加樣器、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、

數(shù)顯恒溫水浴鍋、氣浴恒溫振蕩器、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-4）、光學(xué)顯微鏡、電子分析天平、高速冷凍離心機(jī)（J-26XP）、旋渦混合器（XW-80A）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌分離

將不同奶牛場的患病奶牛乳汁接種于LB肉湯培養(yǎng)基、SC肉湯培養(yǎng)基、乙基紫肉湯培養(yǎng)基、高鹽肉湯培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)菌增菌培養(yǎng)；取適量培養(yǎng)出的菌液分別在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板培養(yǎng)基、高鹽-甘露醇瓊脂培養(yǎng)基表面劃線純化培養(yǎng)，挑取純化后的單菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌鑒定

挑取純化后的可疑單菌落接種于各類培養(yǎng)基中，觀察其菌落形態(tài)及培養(yǎng)基顏色變化；并將待檢菌株接種于各類培養(yǎng)液中，取出一接種環(huán)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢；將待檢菌株進(jìn)行生化鑒定，對生化鑒定不確定菌株進(jìn)一步做細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。

1.3.3 藥物敏感性檢測

根據(jù)CLSI所推薦的微量肉湯稀釋法對分離的菌株進(jìn)行14 種藥物的敏感性檢測。結(jié)果MIC值參照CLSI（2020）和EUCAST（2019）折點(diǎn)值范圍進(jìn)行判定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢出情況

試驗(yàn)采集檢測的193 份樣品中有134 份檢出病原菌，檢出率69.4%；其中65 份檢出兩種及兩種以上菌，占檢出數(shù)的48.5%。值得注意的是，在檢測的32 份隱性乳房炎樣品中，病原菌的檢出率為68.7%，兩種及兩種以上菌占檢出數(shù)的40.9%（表1）。

表1 乳房炎奶樣的培養(yǎng)鑒定結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離情況

試驗(yàn)采集檢測的193 份樣品分離出菌株12 種234 株，包括革蘭氏陰性菌131 株，革蘭氏陽性菌103 株。其中分離率較高的前六種菌分別是：大腸桿菌56 株，分離率23.8%；肺炎克雷伯菌42 株，分離率17.9%；葡萄球菌63 株，分離率26.9%；腸球菌24 株，分離率10.3%；鏈球菌13 株，分離率5.6%；熒光假單胞菌10 株，分離率4.3%（表2）。葡萄球菌屬最高分離率達(dá)26.9%，分離到該屬多種葡萄球菌，其中金黃色葡萄球菌17 株，分離率7.26%。

表2 菌株分離情況

2.3 病原菌藥物敏感性測定結(jié)果

通過最小抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果顯示，質(zhì)控菌大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923對14種抗菌藥的MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi)，表明數(shù)據(jù)真實(shí)可信。對本研究分離到的大腸桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等12 種菌中的10 種細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，不論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌對試驗(yàn)選取的17 種常見抗生素均表現(xiàn)不同程度的耐藥，有部分菌株還表現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥。有些菌株對部分藥物耐藥率達(dá)100%。

56 株大腸桿菌對抗菌藥的敏感性有所不同，對阿莫西林、克林霉素耐藥率較高，分別為73.2%和67.3%，其次是多西環(huán)素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻呋、氟苯尼考、鏈霉素，耐藥率在21.5%～33.9%，對環(huán)丙沙星較為敏感，耐藥率約為10.7%；對氧氟沙星不耐藥。

葡萄球菌對大多數(shù)藥敏感性都不高，尤其是青霉素、頭孢曲松，耐藥率達(dá)到66.7%和60.3%；對環(huán)丙沙星和氧氟沙星敏感性較高，分別為4.8%和6.3%，對其他藥物耐藥率介于19.0%～57.4%之間。

肺炎克雷伯菌對阿莫西林和氨芐西林、克林霉素、磺胺異惡唑高度耐藥，達(dá)97.6%、90.9%、98.9%和87.5%；對環(huán)丙沙星比較敏感，耐藥率為4.8%；對氧氟沙星不耐藥；對其他藥物耐藥率在11.9%～40.5%之間（表3、4）。

表3 病原菌藥物敏感檢測結(jié)果

3 分析與討論

3.1 涼山地區(qū)乳房炎病原菌檢出率

奶牛乳房炎一直是困擾世界奶牛業(yè)的常見疾病，因?yàn)閷?dǎo)致奶牛乳房炎的病因非常復(fù)雜，有機(jī)械損傷、環(huán)境性病原菌、傳染性病原菌等，有研究表明目前能夠?qū)е履膛Ｈ榉垦椎闹虏【蛇_(dá)數(shù)百種[4]。本次試驗(yàn)193 份樣品中，通過分離鑒定有134 份樣品檢出病原菌，檢出率達(dá)69.4%，其中65 份還檢出兩種及兩種以上菌，占檢出數(shù)的48.5%。某些病原菌如奇異變形桿菌、綠膿桿菌、腸球菌等為條件性致病菌，在乳房受損、機(jī)體抵抗力下降、傳染性病原菌感染時(shí)容易引發(fā)乳房炎，這表明混合感染是引起涼山地區(qū)乳房炎的原因之一，也是臨床上治愈困難、病情反復(fù)的原因之一。該研究所采集的臨床型乳房炎樣品中，有30.4%的樣品未檢出病原菌，張俊杰等[8]曾報(bào)道大部分牧場在對全部臨床型乳房炎奶樣進(jìn)行病原菌培養(yǎng)時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)無細(xì)菌生長的比例大約占30.0%，而這30.0%的無菌生長病例可能意味著此階段免疫系統(tǒng)已經(jīng)成功將所感染的病原菌清除，或是因?yàn)槠渌遣≡蜃樱ú《?、真菌等）所致。在本研究中檢出無菌的比例也剛好是30.4%，如果在揭發(fā)乳房炎時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)已經(jīng)成功清除細(xì)菌感染，診斷到的只是機(jī)體自身的炎癥反應(yīng)，那么常規(guī)治療中看到臨床型乳房炎癥狀就使用抗生素治療就是值得反思的，存在一定的不合理性。也可能這些未檢出菌樣本是因?yàn)槠渌虏∫蜃樱ú《尽⒄婢龋┰斐?，所以本試?yàn)方法不能檢出。

3.2 涼山地區(qū)奶牛乳房主要病原菌種類

本次研究在涼山地區(qū)不同養(yǎng)殖規(guī)模、不同管理水平的牧場中，對采集的193 份臨床型乳房炎和隱性乳房炎樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共分離到12 種234 株病原菌。結(jié)果表明，目前在該區(qū)引起乳房炎的主要病原菌主要以葡萄球菌（26.9%）、大腸桿菌（23.8%）、肺炎克雷伯氏菌（17.9%）、腸球菌（10.3%）及鏈球菌（5.6%）為主，占檢出細(xì)菌的84.62%，其中葡萄球菌屬、大腸桿菌及肺炎克雷伯氏菌為優(yōu)勢菌群，這與我國其他地方及國外學(xué)者的報(bào)道有相同之處[9～11]。張明國等[12]曾抽檢了涼山地區(qū)90 余份奶樣，檢出病原菌多達(dá)17 種，其中大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽胞桿菌、奇異變形桿菌、腸球菌在本次試驗(yàn)中仍然檢出，而且部分菌還有較高檢出率。這一結(jié)果提示，奶牛乳房炎防治是一個(gè)長期的過程，區(qū)系菌群在保持相對的穩(wěn)定狀態(tài)中又會(huì)有新的菌群增加，如肺炎克雷伯氏菌。故乳房炎防治中需依靠科學(xué)檢測手段來指導(dǎo)防控，而非經(jīng)驗(yàn)。在加強(qiáng)傳染性病原菌控制的同時(shí)，對環(huán)境型病原菌的控制須更具針對性，環(huán)境型病原菌的治理才是改善該區(qū)乳房炎多發(fā)常發(fā)的根本。

本研究中32 份隱性乳房炎樣品的病原菌檢出率為68.7%，兩種及兩種以上菌占檢出數(shù)的40.9%，說明了牛場開展CMT檢測工作的必要性，檢測出＋＋以上的牛只應(yīng)及時(shí)進(jìn)行隔離治療，防止隱性乳房炎轉(zhuǎn)化為臨床型乳房炎。項(xiàng)目組下一步將持續(xù)關(guān)注對CMT陽性樣本的檢測。

3.3 環(huán)境性病原菌防控措施

本研究中大腸桿菌分離率高達(dá)23.8%，肺炎克雷伯菌分離率達(dá)17.9%。近年來，隨著奶牛集約化養(yǎng)殖模式的推廣以及規(guī)范化擠奶程序、干奶期治療和現(xiàn)代化管理方式的應(yīng)用，傳染性乳房炎病原菌的檢出率有所下降。本研究中金黃色葡萄球菌分離率為7.30%，明顯低于環(huán)境性乳房炎病原菌的分離率。環(huán)境型病原菌導(dǎo)致乳房炎的主要原因是環(huán)境管理不當(dāng)，牛舍內(nèi)潮濕、糞便積累、運(yùn)動(dòng)場淤泥、通風(fēng)不良等應(yīng)激因素，或是奶牛自身體質(zhì)下降，乳房表面有損傷等誘發(fā)因素時(shí)，病原菌突破乳房屏障定植于乳腺可引起奶牛乳房炎。比如大腸桿菌引起乳房炎時(shí)，雖然機(jī)體可吞噬殺滅感染的大腸桿菌但產(chǎn)生的大量內(nèi)毒素對牛體產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。而在本研究中筆者曾采集牛場糞樣檢測，幾乎全部糞樣中均檢出大腸桿菌。所以在該區(qū)要減少大腸桿菌引起的乳房炎，必須制定切實(shí)有效的糞污管理辦法，保證牛床干燥整潔，減少蚊蠅滋生，特別加強(qiáng)墊料糞污管控，減少接觸將是行之有效的方法。

3.4 減少該地區(qū)乳房炎主要病原菌產(chǎn)生耐藥性措施

在本研究中不論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌，對試驗(yàn)選取的17 種常見抗生素均表現(xiàn)不同程度的耐藥，有部分菌株還表現(xiàn)嚴(yán)重的多重耐藥，有些菌株對部分藥物耐藥率達(dá)100%。究其原因，現(xiàn)階段本地區(qū)乳房炎治療仍以抗生素為主，科學(xué)的抗生素使用方法須先對乳房炎陽性牛進(jìn)行病原菌分離，然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選有效抗生素進(jìn)行治療。但是，涼山地區(qū)多數(shù)中小型奶牛場根本無條件在場內(nèi)開展檢測工作，長期的抗生素應(yīng)用沒有針對性，或者本身已經(jīng)產(chǎn)生耐藥了而還在使用，從而導(dǎo)致耐藥菌株甚至超級細(xì)菌的出現(xiàn)。要解決該問題，需定期開展相應(yīng)的試驗(yàn)檢測，進(jìn)行指導(dǎo)性用藥，在臨床用藥中盡可能選擇窄譜的低耐藥性抗生素；在選擇藥物時(shí)，嚴(yán)格遵循藥物適應(yīng)癥；交替循環(huán)使用常用的抗生素，在一種藥物產(chǎn)生耐藥后暫停使用或換為另一類抗菌機(jī)制不同的藥物，則細(xì)菌對藥物產(chǎn)生的耐藥會(huì)逐漸消退；還應(yīng)注意科學(xué)的用藥劑量和用藥療程，隨意改變劑量和療程也是抗生素產(chǎn)生耐藥的原因[4]。

3.5 建議新的乳房炎防治辦法

本研究中不論是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌，對β-內(nèi)酰胺類和林可胺類抗生素普遍耐藥，耐藥率均在50%以上，甚至全部耐藥；對喹諾酮類抗生素敏感性較高，敏感率基本達(dá)到80%以上。據(jù)奶牛場現(xiàn)場調(diào)查，β-內(nèi)酰胺類和林可胺類確實(shí)為目前場內(nèi)使用較多的藥物，在今后臨床用藥中需謹(jǐn)慎選擇使用，可考慮使用喹諾酮類抗生素來達(dá)到治療效果。在其他疾病治療方面，越來越多的中藥及中成藥得以大量應(yīng)用，在后期可更多嘗試。張鵬舉等[13]使用公英翹蘆散治療乳房炎7 天，治愈率達(dá)到62.67%，有效率達(dá)到90.67%。陸福強(qiáng)等[14]使用中藥組方黃芪100 g、黨參80 g、川芎75 g、白術(shù)30 g、黃連60 g，將中藥組合為1 個(gè)劑量，并在此基礎(chǔ)上以10 倍水進(jìn)行煎制，在1.5 h后取中藥湯劑，剩余的殘?jiān)梢约尤? 倍水繼續(xù)煎制約1 h，將湯劑進(jìn)行混合，內(nèi)服，每天1 劑，治療奶牛乳房炎取得顯著效果。受本區(qū)域氣候、地理環(huán)境、病原菌區(qū)系菌群等多方因素影響，如能在涼山篩選出適宜于本地域的奶牛乳房炎防治方劑，將大大降低抗生素的使用，為乳品安全提供保障。